Caracterização da enzima 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintase para desenvolvimento de biossensor para detecção de glifosato

Abstract

A 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintase (EPSPS, EC 2.5.1.19) é a enzima que catalisa a sexta etapa da via do shikimato, cujo produto final, corismato, é precursor da biossíntese dos aminoácidos aromáticos e, por consequência, da produção de diversos metabólitos secundários necessários às plantas e microrganismos. O glifosato, inibidor da EPSPS, é atualmente o herbicida mais utilizado no Brasil, o que causa um acúmulo deste agroquímico em corpos de água. Embora não haja consenso pelas agências reguladoras, o glifosato é classificado como provável carcinógeno humano pela Agência Internacional para Pesquisa sobre Câncer, além de existirem outros estudos que o sugerem como agente causador de outras comorbidades humanas. Assim, este trabalho se propõe a caracterizar a EPSPS de Escherichia coli (Ec-EPSPS) para desenvolvimento de um biossensor por ressonância plasmônica de superfície (SPR), visando a detecção do glifosato presente na água. O gene da Ec-EPSPS foi clonado em vetores pET-M11 e pET-SUMO, que foram inseridos em bactérias E. coli BL21 (DE3) e Rosetta por transformação de choque térmico. Foram realizados testes de expressão da Ec-EPSPS em meio LB e ZYM-5052. O clone BL21 (DE3) transformado com pET-M11 expressou a proteína solúvel em meio ZYM-5052. A purificação da proteína foi realizada em duas etapas: cromatografia de afinidade a metal imobilizado, e cromatografia de exclusão molecular. Dados de dicroísmo circular apontam que a Ec-EPSPS mantém seu conteúdo de estruturas secundárias entre os pH 4,0 e 9,0, e é termoestável entre 10 ºC e 50 ºC em pH 7,5. Ensaios de atividade mostram que a Ec-EPSPS obtida neste estudo está ativa, apresentando Km para shikimato-3-fosfato e fosfoenolpiruvato em 0,055 ± 0,018 mM e 0,148 ± 0,023 mM, respectivamente. A Ec-EPSPS é classificada como classe I entre as EPSPS, ou seja, é inibida em concentrações micromolares de glifosato. Isso foi demonstrado por ensaio de inibição, onde o IC50 foi determinado em 0,016 ± 0,006 mM. Todos os dados aqui apresentados quanto à afinidade da Ec-EPSPS por seus substratos e inibidor estão de acordo com os encontrados na literatura. Em relação às análises por SPR, foi observado um deslocamento de 0,75° entre os pontos mínimos das curvas de ressonância, que representam o sistema antes e depois da aplicação de Ec-EPSPS. Esse deslocamento pode estar relacionado à imobilização da proteína à superfície dos chips, através da sua cauda de histidina. Porém, o sistema empregado até então não é capaz de verificar a presença de glifosato em solução, mesmo em concentrações altas. Outros trabalhos publicados na literatura, que utilizaram equipamentos já estabelecidos no mercado, obtiveram resultados mais satisfatórios quanto ao uso de SPR para detecção de glifosato. Os resultados destes são discutidos neste trabalho, a fim de ressaltar o potencial da técnica de SPR para análises ambientais.