Análises proteômica e fosfoproteômica de células Aag-2 de Aedes aegypti infectadas com os arbovírus MAYV e CHIKV

Abstract

Mayaro virus (MAYV) e Chikungunya virus (CHIKV) são dois arbovírus pertencentes ao gênero Alphavirus e que são transmitidos pelo mosquito Aedes aegypti. Enquanto o MAYV é endêmico da América do Sul, o CHIKV já foi responsável por epidemias em todo o globo. Os elevados números de casos de arboviroses pelo mundo e o fato de muitas populações de mosquitos serem resistentes a inseticidas levaram à necessidade de desenvolvimento de estratégias alternativas de controle desses vírus. Houve um aumento expressivo na quantidade de estudos focados na interação vírus-vetor, muitos deles analisando aspectos moleculares, como as proteínas envolvidas nessa interação. Neste sentido, o presente estudo abordou a análise proteômica de células Aag-2 de Ae. aegypti infectadas com CHIKV em multiplicidade de infecção (MOI) 0,1 e tempos de coleta t = 0 h, 12 horas pós-infecção (h p.i.) e 48 h p.i. As amostras, em triplicatas biológicas, foram identificadas por espectrometria de massas após redução, alquilação e digestão. Entre outros resultados, foi observada uma maior abundância de proteínas relacionadas à tradução em 12 h p.i., enquanto proteínas relacionadas à produção de energia, em 48 h p.i. As imagens de microscopia eletrônica de transmissão revelaram, além de muitas partículas virais, mitocôndrias com formato alongado em 48 h p.i. Tal morfologia pode ser consequência de um provável desbalanço da rede mitocondrial decorrente da infecção viral, gerando uma maior demanda energética. Ademais, sabese que a fosforilação de proteínas está altamente relacionada à regulação espaçotemporal de diversos processos essenciais ao funcionamento dos organismos. Como os vírus sequestram a maquinaria celular do hospedeiro para sua própria replicação, espera-se encontrar uma modulação diferencial no padrão de fosforilação nas células infectadas. Assim, objetivou-se realizar uma análise fosfoproteômica de células Aag-2 infectadas com MAYV e CHIKV no presente trabalho. Foi realizada uma predição in silico de fosfoproteínas de Ae. aegypti e as 433 proteínas resultantes foram enriquecidas para processos como autofagia e via de sinalização MAPK. Para as análises experimentais, foram utilizados o MOI 1 e os tempos de coleta t = 0 h, 2 h p.i., 4 h p.i., 8 h p.i. e 12 h p.i., em quadruplicatas biológicas. As proteínas extraídas a partir das células Aag-2 foram utilizadas para Western Blot e espectrometria de massas. Os ensaios de Western Blot contra anticorpos anti-fosfoserina, fosfotirosina e fosfotreonina apresentaram diferentes padrões de marcação na comparação por anticorpo. A partir do processamento do extrato total de proteínas para a espectrometria de massas e dessalinização, foi realizado o enriquecimento de fosfopeptídeos por colunas de dióxido de titânio (TiO2). Após a obtenção dos dados da análise por espectrometria de massas, a análise de bioinformática nos permitirá verificar a influência da infecção por MAYV e CHIKV sobre a homeostase das células hospedeiras de Ae. aegypti nas vias metabólicas que são reguladas por eventos de fosforilação.