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Veuillez utiliser cette adresse pour citer ce document : http://repositorio.unb.br/handle/10482/48780
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Titre: Integração de estratégias computacionais e experimentais para a investigação da proteína ligante de odor (OBP) salivar de Rhodnius Neglectus, vetor da Doença de Chagas
Auteur(s): Silva, Gabriel dos Santos
Orientador(es):: Araújo, Carla Nunes de
Coorientador(es):: Mottin, Melina
Assunto:: Odorant binding protein
Rhodnius neglectus
Chagas, Doença de
Date de publication: 11-jui-2024
Référence bibliographique: SILVA, Gabriel dos Santos. Integração de estratégias computacionais e experimentais para a investigação da proteína ligante de odor (OBP) salivar de Rhodnius Neglectus, vetor da Doença de Chagas. 2023. 100 f., il. Dissertação (Mestrado em Ciências Médicas) — Universidade de Brasília, Brasília, 2023.
Résumé: O Rhodnius neglectus, um inseto da família Reduviidae (Hemiptera), é um potencial vetor do Trypanosoma cruzi, o protozoário responsável pela doença de Chagas. Na saliva do R. neglectus, encontram-se moléculas importantes que neutralizam os mecanismos de coagulação do hospedeiro, auxiliando na alimentação sanguínea e, indiretamente, na transmissão do protozoário. Por isso, a saliva desse inseto hematófago tem sido alvo relevante de estudos devido à presença de moléculas com alto potencial biotecnológico. Este trabalho teve como objetivo estudar uma Proteína de Ligação a Odorantes da saliva do R. neglectus (RnOBP) visando contribuir na compreensão de suas características estruturais e funcionais, utilizando abordagens computacionais e experimentais. Foram realizadas modelagens moleculares da RnOBP e ensaios computacionais de dinâmica molecular e clusterização para obter informações sobre a flexibilidade da proteína. Em seguida, foram realizados ensaios de docking molecular para verificar a afinidade da RnOBP com alguns ligantes relacionados à coagulação de vertebrados. Por fim, observou-se uma possível forma de oligomerização da RnOBP. Para a obtenção da RnOBP recombinante, a sequência nucleotídica da proteína foi obtida a partir do transcriptoma do R. neglectus, clonada no vetor de expressão pET100/D-TOPO e produzida por bactérias Escherichia coli Rosetta(DE3)pLysS. A RnOBP recombinante foi purificada por cromatografia de afinidade, renovelada e utilizada em ensaios de caracterização biofísica. O modelo gerado pelo Alphafold mostrou que a RnOBP é formada por hélices α e possui uma cavidade interna significativa, potencialmente um sítio de ligação. Em comparação com outras OBPs de insetos, independentemente da composição ou classificação da OBP, a região do sítio de ligação é bem conservada. A RnOBP recombinante purificada a partir de corpos de inclusão revelou uma composição de estrutura secundária diferente da esperada. Os ensaios funcionais iniciais mostraram que a rRnOBP pode atuar na inibição da agregação plaquetária, mas não a coagulação. Este estudo mostrou propriedades estruturais da RnOBP e pode contribuir para a compreensão de suas funções e potencial biotecnológico.
Abstract: Rhodnius neglectus, an insect from the Reduviidae family (Hemiptera), is a potential vector of Trypanosoma cruzi, the causative protozoan of Chagas disease. Triatomine saliva comprises a rich mixture of molecules synthesized by the salivary glands to counter host responses, aid the uptake of blood and, indirectly, T. cruzi transmission. Therefore, the saliva of this hematophagous insect has been a relevant subject of studies due to the presence of these molecules with high biotechnological potential. The goal of this work was to study an Odorant Binding Protein from R. neglectus saliva (RnOBP) using computational and experimental approaches aiming, to contribute to the understanding of its structural and functional characteristics. RnOBP molecular modeling, computational molecular dynamics and clustering tests were performed to obtain information about the protein's flexibility. Next, molecular docking assays were carried out to verify the affinity of RnOBP with agonists of vertebrate coagulation pathways. Finally, putative RnOBP oligomers were observed. To obtain the recombinant RnOBP, its nucleotide sequence was obtained from the R. neglectus transcriptome, cloned into the pET100/D-TOPO expression vector and produced by Escherichia coli Rosetta(DE3)pLysS bacteria. The recombinant RnOBP was purified by affinity chromatography, refolded, and used in biophysical characterization assays. This protein is modeled to be entirely formed by α-helices and have a significant internal cavity, potentially a ligand-binding site. Compared with insect OBPs, regardless of the composition or classification of the OBP, the binding site region is well conserved. The recombinant RnOBP purified from inclusion bodies revealed a secondary structure composition different than expected. Initial functional indicated rRnOBP could act to inhibit platelet aggregation, but not coagulation. This study showed RnOBP structural properties and may contribute to the understanding of its functions and biotechnological potential.
metadata.dc.description.unidade: Faculdade de Medicina (FMD)
Description: Dissertação (mestrado) — Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas, 2023.
metadata.dc.description.ppg: Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas
Collection(s) :Teses, dissertações e produtos pós-doutorado

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