Expressão heteróloga e caracterização bioquímica de amilases putativas de bactérias termófilas

Abstract

Amilases estão entre as hidrolases mais utilizadas em processos biotecnológicos, podendo ser aplicadas em indústrias têxteis, alimentícias, de detergentes, de produção de papel e de biocombustíveis. O fato de as amilases apresentarem uma grande relevância no mercado mundial de enzimas e de os microorganismos termófilos produzirem enzimas mais resistentes a processos industriais faz com que haja um crescente interesse em termoamilases. Neste contexto, o presente trabalho teve como objetivos a clonagem e expressão de genes putativos de amilases das bactérias termófilas Clostridium thermocellum (Cthe_0795 e Cthe_2191) e Paenibacillus barengoltzii (Amy1), e a caracterização das proteínas heterólogas para avaliar seu potencial de aplicação industrial. Análises de bioinformática para todos os genes foram realizadas, incluindo mapeamento de domínios conservados, predição de peptídeo sinal, alinhamentos de sequências e montagem de árvore filogenética com diferentes amilases já caracterizadas provenientes de procariotos. Os três genes Cthe_0795, Cthe_2191 e Amy1 contêm o domínio GH13 das glicosil hidrolases, com identidade de 84,52% com “pululanases” (Best hit: Hungateiclostridium mesophilum), 92,40% com “glycogen branching enzymes” (Best hit: Hungateiclostridium straminisolvens), e 91,93% com “alfa amilases” (Best hit: Paenibacillus rubinfantis). Cthe_0795, Cthe_2191 e Amy1 foram clonados em Escherichia coli BL-21 DE3 utilizando pET 21a; pGEM T e pET21a; e pET21a, respectivamente. A proteína recombinante codificada por Cthe_2191, GlB, foi parcialmente purificada e apresentou atividade enzimática sobre amilose. A proteína recombinante codificada por amy1, AMYPb, foi purificada e caracterizada bioquimicamente, apresentando maior atividade na temperatura de 60°C e pH nas faixas 7 e 8. A enzima manteve 40% da sua atividade após 3 horas de incubação a 50°C, e em torno de 80% quando incubada a 50oC por 2 horas em pH 7, 8 e 9. Os íons CaCl2, MgCl2, MnCl2, KCl, NaCl, CuCl2, NiCl2 e EDTA, nas concentrações de 1mM e 10mM não alteraram a sua atividade, sendo completamente inibida por FeCl3 a 10mM. Tais propriedades bioquímicas fornecem uma boa perspectiva inicial para a aplicação de AMYPb em processos biotecnológicos carreados em condições de temperaturas elevadas e pHs alcalinos baseados na hidrólise do amido, por exemplo.