Expressão heteróloga e caracterização de LPMOs de trichoderma harzianum TR 274

Abstract

As monooxigenases líticas de polissacarídeos (LPMOs) são enzimas auxiliares dependentes de cobre. Seu mecanismo oxidativo permite a ação dessa enzima na superfície da microfibrila cristalina de celulose, onde as cadeias polissacarídicas estão mais fortemente associadas. O fungo Trichoderma harzianum é reconhecido há décadas por sua capacidade em realizar o controle biológico de agentes fitopatogênicos, no entanto, o grande potencial de produção de enzimas ativas sobre carboidrato por esse fungo é de conhecimento mais recente. A caracterização enzimática de proteínas auxiliares oriundas desse fungo é escassa na literatura, assim como a aplicação de tais enzimas em ensaios de sinergismo para hidrólise de substratos insolúveis com a braquiária e o bagaço-de-cana. Análises computacionais revelaram a presença de 6 genes codificadores de LPMOs no genoma do isolado T. harzianum TR 274 mantido na coleção de fungos do Laboratório de Enzimologia da UnB, sendo que estas enzimas ainda não foram caracterizadas. O presente trabalho visa a expressão heteróloga das LPMOs dos genes triha 131108 (atividade auxiliar 9) e triha 503137 (atividade auxiliar 11) deste isolado na levedura Komagataella phaffii e do gene triha 503137 em Escherichia coli para possível aplicação industrial. O gene triha 131108 foi obtido por RT-PCR, clonado em pGEM®-T Easy e subclonado em PPIC9. Devido a dificuldade de clonagem do gene triha 503137, esse foi sintetizado quimicamente por uma empresa especializada. Ambas construções foram utilizadas na transformação da levedura K.phaffii por eletroporação. Para expressão da proteína recombinante, a levedura foi cultivada em meio BMGY e inoculada em BMMY com metanol para indução da transcrição. O sobrenadante foi coletado com 24, 48 e 72 e 96 horas de expressão. Para expressão do gene triha 503137 em E.coli, o gene de interesse foi subclonado em pET-28a a partir do vetor PPIC9-LPMO503. A expressão da proteína heteróloga ocorreu em meio autoindutor contendo lactose. Foram coletadas as frações solúveis e insolúveis do cultivo celular após ultrassonicação. Tais amostras foram utilizadas para precipitação de proteínas com TCA/acetona e corridas em gel SDS-PAGE. Os resultados do gel SDS-PAGE da proteína triha 131108 apontaram para a possível expressão da proteína heteróloga em tamanho correto. A proteína LPMO 503 foi expressa com sucesso em E.coli, tendo sido confirmada por western blot. Para determinação do perfil de expressão gênica dos 6 genes de LPMOs de T.harzianum contidos em banco de dados, foi realizado o experimento de qPCR com o fluoróforo SYBR Green. Os resultados preliminares indicam uma maior qualidade na obtenção de dados de expressão relativa ao se utilizar o conjunto de primers dos genes de Actina e a-tubulina como genes de referência em comparação a utilização de actina e fator de elongação alfa. Foi possível também verificar o aumento da expressão dos genes triha488374 e triha99387 no cultivo do fungo em bagaço-de-cana e braquiária.