Deleção e caracterização funcional do gene pksA codificador da enzima Policetídeo Sintase Tipo I em Fonsecaea pedrosoi

Abstract

Fonsecaea pedrosoi é um fungo filamentoso melanizado e o principal agente causador da cromoblastomicose (CBM). CBM é uma micose subcutânea crônica e recalcitrante causada por implantação traumática e é considerada uma doença tropical negligenciada (DTN). A melanina é considerada um dos principais fatores de virulência conhecidos deste patógeno e é sintetizada pela via DHN-melanina (1,8-di-hidroxinaftaleno) e pode ser caracterizada por propriedades como: alto peso molecular, muito estável, carregada negativamente, resistente à degradação por ácidos, suscetível à degradação por bases fortes, hidrofóbica e insolúvel em solventes orgânicos. Esta via começa com o policetídeo 1,3,6,8-tri-hidroxinaftaleno (THN), seguido pela redução para scitalone, que é reduzida para vermelone e desidratada para DHN. Após esta etapa, a DHN é polimerizada para formar a melanina DHN. Para caracterizar os efeitos da melanina sintetizada via DHN-melanina em F. pedrosoi, o gene pksA da proteína policetídeo sintase tipo I, responsável pela primeira etapa da via biossintética da DHN, foi deletado por biolística. Cassetes de deleção foram construídos por reação em cadeia da polimerase de dupla junta (DJ-PCR) e vinte e cinco transformantes albinos foram obtidos, sendo oito confirmados para a deleção de pksA. Dois mutantes de diferentes transformações foram usados para avaliar o papel de pksA na biologia e patogenicidade de F. pedrosoi. Foi observado que o mutante ∆pks possui crescimento e germinação significativamente atrasados, bem como apresenta menor taxa de viabilidade dos conídios. Dentre os ensaios com estressores, o mutante apresentou maior sensibilidade ao estresse osmótico (KCl e Sorbitol), Oxidativo (Menadiona) e estresse de parede celular (CFW). Curiosamente, não foi observado diferença significativa na viabilidade conidial frente ao estresse com exposição a diferentes doses de UV. A melanina conferiu maior resistência à atividade fungicida, mesmo com macrófagos estimulados com LPS e LPS+IFNγ. Por fim, notou-se que a melanina exerce importante papel no aumento da patogenicidade de F. pedrosoi in vivo com Galleria mellonella.