Baculovírus como vetor para expressão da glicoproteína do vírus da raiva em células de inseto e de mamífero e análise transcricional de células infectadas com vírus da dengue

Abstract

No Brasil, a raiva e a dengue podem ser citadas como duas doenças que causam prejuízos econômicos. A raiva é uma doença causada por um vírus do gênero Lyssavirus, transmitida pela saliva de mamíferos infectados, e uma vez iniciados os sintomas, a mortalidade ocorre em praticamente todos os casos. O vírus da raiva é formado por cinco proteínas: a nucleoproteína, a fosfoproteína, a proteína de matriz, a RNA polimerase e a glicoproteína (GPV), principal proteína viral imunogênica. Neste trabalho, a GPV foi expressa em células de mamíferos utilizando um baculovírus recombinante. Baculovirus são vírus de insetos que têm sido amplamente utilizados como biopesticidas e como ferramenta para a expressão de proteínas heterólogas em células de inseto e de mamíferos. Eles são considerados seguros devido à sua especificidade ao hospedeiro e a incapacidade de se replicar em linhagens de células não-inseto, embora eles possam entrar nas células de mamíferos. Para a construção do vírus recombinante, um fragmento gênico contendo o promotor CMV e o gene GPV foi clonado no vetor pFastBac1. O vírus recombinante AcCMV-GPV foi obtido através do sistema Bac-to-Bac (Invitrogen) e foi usado para infectar células de inseto. O extrato celular foi analisado por SDS-PAGE e a presença da proteína GPV foi confirmada por western blot usando um anticorpo anti-vírus da raiva. Células HeLa, derivadas de hepatoma humano, foram transduzidas com o vírus recombinante e o extrato celular também foi analisado por SDS-PAGE e a proteína GPV marcada com o anticorpo anti-vírus da raiva. Células HuH-7, derivadas de hepatócitos humanos, foram transduzidas com o vírus recombinante e a proteína GPV foi quantificada através de um ELISA. Futuramente, testes in vivo poderão ser feitos a fim de analisar os efeitos imunogênicos do vírus recombinante. Baculovírus recombinante capaz de expressar GPV em células de mamíferos pode ser uma alternativa para o desenvolvimento de uma vacina contra a raiva a custos mais baixos. A dengue é uma doença tropical e tem se tornado um grave problema de saúde pública. A doença é causada pelo vírus da dengue (dengue virus, DENV), um Flavivirus composto de quatro sorotipos (DENV-1 a 4), todos transmitidos ao ser humano através da picada da fêmea de mosquitos do gênero Aedes. O DENV se replica tanto em células de vertebrados como nas células do mosquito. Há muito conhecimento sobre os mecanismos de entrada e replicação de Flavivirus em cultura de células de mamífero e seus efeitos in vivo. No entanto, pouco se sabe a respeito dos processos moleculares do vírus no vetor. Dentro desse contexto, o presente trabalho propos a análise transcricional de células de Ae. albopictus (C6/36) infectadas com DENV-1, isolado do Distrito Federal. Doze horas pósinfecção, as células foram coletadas, o RNA total de células infectadas e não infectadas foi extraído e utilizado para confecção da biblioteca subtrativa de cDNA, através da técnica de Representational Difference Analysis (RDA). Os cDNAs amplificados foram clonados no vetor pGEM-T Easy e seqüenciados. Cerca de 300 clones foram seqüenciados e as seqüências obtidas foram analisadas em um banco de dados. Infelizmente, a maioria das seqüências foi de RNA ribossomal. Tal resultado indica que houve problemas técnicos na construção da referida biblioteca. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT

In Brazil, rabies and dengue fever may be cited as two diseases that cause economic impacts. Rabies is a disease caused by a virus of the genus Lyssavirus and it is transmitted through the saliva of infected mammals. Once the symptoms started, the mortality occurs in virtually all cases. The rabies virus is composed of five proteins: nucleoprotein, phosphoprotein, matrix protein, RNA polymerase and glycoprotein (GPV), the main immunogenic viral protein. In this work, the GPV was expressed in mammalian cells using a recombinant baculovirus. Baculovirus are insect viruses that have been widely used as biopesticides and as a tool for expression of heterologous proteins in insect and mammalian cells. They are considered safe due to their host specificity and the inability to replicate in non-insect cell lines, although they can enter in mammalian cells. To construct the recombinant virus, a gene cassete containing the CMV promoter and the GPV gene was cloned into the vector pFastBac1. The recombinant AcCMV-GPV was obtained by Bac-to- Bac system (Invitrogen) and was used to infect insect cells. The cell extract was analyzed by SDS-PAGE and the presence of the GPV protein was confirmed by western blot using an antibody anti-rabies virus. HeLa cells, derived from human hepatoma, were transduced with the recombinant virus, the cell extract was also analyzed by SDS-PAGE and the GPV protein was labeled with the same antibody. Huh-7 cells derived from human hepatocytes were transduced with the recombinant virus and the protein was quantified by ELISA. In future, in vivo tests can be done to examine the immunogenic effects of the recombinant virus. Recombinant baculovirus expressing GPV in mammalian cells may be an alternative for the development of vaccine against rabies at lower costs. Dengue is a tropical disease and has become a serious public health issue. The disease is caused by dengue virus (DENV), a Flavivirus, which has four serotypes (DENV-1 to 4), all transmitted to humans through the bite of female mosquitoes of the genus Aedes. The DENV replicates in both vertebrate and mosquito cells. There are a lot of knowledge about the mechanisms of Flavivirus entry and replication in mammalian cell culture and its effects in vivo. However, little is known about the molecular processes of the virus in the vector. In this context, this paper proposes cell transcriptional analysis of Ae. albopictus cells (C6/36) infected with DENV-1, isolated from Distrito Federal. Twelve hours after infection, cells were collected, total RNA from infected and uninfected cells was extracted and used to construct a subtractive cDNA library, using the technique of Representational Difference Analysis (RDA). The amplified cDNAs were cloned into pGEM-T Easy vector and sequenced. About 300 clones were sequenced and the sequences were analyzed in a database. Unfortunately, most of the sequences were ribosomal RNA. This result indicates that there were technical problems in building the library.