Prolil oligopeptidases de tripanossomos : aspectos estruturais e funcionais

Abstract

A linha de pesquisa do nosso grupo visa à identificação e caracterização de alvos potenciais para a quimioterapia da doença de Chagas tendo as proteases como principal enfoque, uma vez que estão envolvidas em processos biológicos fundamentais para a viabilidade e virulência de patógenos. Neste contexto, essa tese aborda alguns aspectos estruturais e funcionais de serino-proteases pertencente à família Prolil Oligopeptidase: a oligopeptidase B (OPBTc) e prolil oligopeptidase (POPTc 80) de Trypanosoma cruzi e a prolil oligopeptidase (POP Tb) de Trypanosoma brucei. A OPBTc participa da invasão celular por meio do recrutamento e fusão de lisossomos da célula hospedeira até o local de ligação do parasito por uma via dependente de Ca2+. Por meio deste trabalho, a OPBTc tornou-se a primeira oligopeptidase B a ter sua estrutura dimérica confirmada por ultracentrifugação analítica. Experimentos de dicroísmo circular mostraram que em altas temperaturas, a enzima conserva sua estrutura secundária, mas não a terciária. A perda da estrutura terciária por tratamento térmico acompanha a diminuição da atividade da enzima e a perda da dimerização, que ocorrem a partir de 50 °C. No entanto, a associação do dímero é resistente a altas concentrações de sal e a tratamento com reagentes redutores, indicando que esta interação não ocorre devido a pontes dissulfeto intermoleculares. Este trabalho também mostra a caracterização funcional da POP de T. brucei, protozoário causador da doença do sono. Esta protease foi capaz de hidrolisar colágeno tipo I semi-purificado in vitro e colágeno nativo em mesentério de rato, além de peptídeos hormonais. Foi observado ainda, que POP Tb é liberada na corrente sanguínea de camundongos infectados pelo T. brucei, onde permanece ativa, sugerindo sua contribuição para a patogênese da doença do sono. Como já proposto em estudos prévios, a POP Tc80 está envolvida na entrada do T. cruzi em célula hospedeiras não fagocíticas e alguns de seus substratos naturais foram caracterizados mostrando que a mesmo hidrolisa colágenos do tipo I e IV e fibronectina. O mecanismo desta catálise não é completamente entendido, porém cálculos de interação entre o modelo estrutural teórico da POP Tc80 com o colágeno mostraram que ocorre uma abertura dos domínios da enzima para entrada do substrato. Para verificar essa hipótese, mutações sítios dirigidas na POP Tc80 acarretaram na perda da sua atividade devido à rigidez da enzima, impedindo o acesso do substrato à fenda catalítica. Finalmente, ainda na tentativa de esclarecer o papel da POP Tc80 na infecção do T. cruzi, foi montada uma estratégia para silenciar seu gene. Os resultados preliminares indicam que um alelo do gene poptc80 sofreu recombinação homóloga sendo trocado pelo marcador de seleção, o gene de resistência a neomicina.