Análise proteômica comparativa entre neutrófilos quiescentes e neutrófilos ativo por n-formil-metionil-leucil-fenilalanina (fMLP)

Abstract

Os neutrófilos são células do sistema imune responsáveis pelo combate inicial contra microrganismos, tais como bactérias e fungos. Possuem uma vida curta, em torno de 6 a 10h na circulação periférica sendo os primeiros a chegarem ao local injuriado. Os neutrófilos podem ser ativados por várias substâncias, entre elas o fMLP (N-formil Metionil-Leucil-Fenilalanina), um peptídeo presente em bactérias Gram-positivas responsável pela ativação dos neutrófilos principalmente em pacientes acometidos por sepse. Essa ativação envolve proteínas centrais na produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) como ERK, p38MAPK e PKC, envolvidas não só na montagem da NADPH oxidase, mas também na reorganização do citoesqueleto favorecendo os processos de desgranulação, transmigração e diapedese. Além da produção de ROS, também são produzidas inúmeras citocinas e quimiocinas, assim como mediadores da inflamação como prostaglandinas e leucotrienos. O presente estudo tem como objetivo comparar o mapa proteômico ácido de neutrófilos quiescentes com o mapa proteômico ácido de neutrófilos ativados com fMLP, evidenciando proteínas com expressão diferencial significativa. A comparação revelou 157 spots exclusivos da condição quiescente, sendo sete identificadas [CLIC1 (canal de cloreto), Dimethylglycine Dehydrogenase (desmetila a N-dimetilglicina em sarcosina e formaldeído), PIPTβ (transporta fosfatidilcolina e fosfatidilinositol sem gasto de energia), Scinderin (proteína estrutural responsável pela fragmentação da actina), Rab 14 e Rabaptin_Rab2GTPase (ambas envolvidas no transporte de grânulos no RE e Complexo de Golgi)] e 77 spots exclusivos da condição fMLP, sendo três proteínas identificadas [Posmeiotic Segregation Increased 2 (envolvido no reparo celular), Pyrophosphatase (hidrolisa o pirofosfato em fosfato inorgânico) e Coactosin like protein (F-actina envolvida na formação de LTB4)]. O mesmo pareamento possibilitou a detecção de spots diferencialmente expressos, sendo 24 com expressão significativamente aumentada para fMLP e três identificadas [Vimentin (filamento intermediário), Septin 11 (atua reorganizando os microtubulos e actina durante a desgranulação) e CLIC4 (canal de cloreto)] e 28 spots com expressão diminuída para fMLP, sendo sete identificadas [Promyelocite Leukemia Protein (envolvida na mutação do receptor do ácido retinóico); Zinc Finger (proteína efetora com sítio de ligação para PIP3); Modulator of retrovirus infection (modula o proteassoma diminuindo a degradação de material genético viral), tubulin1B, tubulin1A e tubulin4A (formam os microtubulos presentes no citoesqueleto). _______________________________________________________________________________ ABSTRACT

Neutrophils are cells of the immune system that are the first-responders against microorganisms, like bacteria and fungus. They have a short-life, that lasts from 6 up to 10 hours in peripheral blood, migrating quickly to the injured area. Neutrophils can be activated by various substances, like fMLP, a bacterial Gram-positive peptide responsible for the neutrophil activation in patients who were stricken by sepsis. This activation involves central proteins in reactive oxygen species (ROS) production like ERK, o38MAPK and PKC. The activation of neutrophils caused by fMLP is not restricted to the NADPH oxidase assembly, but also includes the cytoskeleton reorganization, favoring the degranulation process, transmigration and cell extravasation. Besides the ROS production, cytokines and chemokines are also produced, along with inflammation mediators like prostaglandines and leukotrienes. This research has as objective to compare the proteomic map of quiescent neutrophils with the proteomic map of fMLP activated ones, highlighting proteins with significant differential expression. The proteomic map pairing of quiescent and fMLP activated neutrophils revealed 157 exclusive spots of the quiescent cells, and 7 from these proteins were identified [CLIC1 (chloride channel), Dimethylglycine Dehydrogenase (demethylates the N-dimethylglicine in sarcosine and fornaldehyde), PIPTβ (transports phosphatidilinositol with no energy cost), Scinderin (structural protein responsible for the fragmentation of actinin), Rab 14 and Rabaptin_Rab2GTPase (both proteins involved in the transport of granules in the ER and Golgi Apparatus)] and 77 spots exclusive of fMLP activated neutrophils, 3 of which were identified [Posmeiotic Segregation Increased 2 (involved in cell repair), Pyrophosphatase (hydrolyses the pyrophosphate in inorganic phosphate) and Coactosin like protein (F-actin involved in LTB4 formation)]. This pairing also resulted in detection of differentially expressed proteins, 24 with up regulated expression by fMLP. Also, 28 spots presented down-regulated expression by fMLP. Among the statistically verified spots, three proteins with up-regulated expression by fMLP: Vimentin (intermediary filament), Septin 11 (acts reorganizing the microtubules and actin during degranulation) and CLIC4 (chloride channel) and seven proteins with down-regulated expression by fMLP: Promyelocite Leukemia Protein (involved in the retinoic acid mutation), Zinc Finger (effector protein with PIP3 bond site), Modulator of retrovirus infection (protein that regulates the proteasome, diminishing the viral genetic material degradation), tubulin1B, tubulin 1A and tubulin 4A (forms the microtubules present in the cytoskeleton)