Produção de hidrolases pelo fungo Dicyma pulvinata, caracterização bioquímica de uma proteinase e purificação parcial desta enzima

Abstract

O fungo Dicyma pulvinata (Deuteromycotina: Hyphomycete), apresenta grande potencial de uso em biocontrole de doenças de plantas, e tem sido encontrado em lesões induzidas pelo fungo Microcyclus ulei (Ascomycete), em folhas de seringueira (Hevea spp.). Esta doença, mal-das-folhas da seringueira, constitui fator limitante para a produção de látex e para a expansão da cultura no Brasil e em outros países da América Latina. O controle biológico do M. ulei, pelo fungo D. pulvinata, vem sendo apontado como promissor, pois o antagonista coloniza estromas do fitopatógeno, impedindo sua esporulação e, conseqüentemente, reduzindo o desfolhamento das plantas e a taxa de inóculo para reinfecções. É atualmente aceito que enzimas hidrolíticas, principalmente quitinases, b- glucanases e proteases produzidas por fungos com capacidade antagônica hidrolisam componentes da parede celular de fungos fitopatogênicos causando assim, sua destruição. Acredita-se, portanto, que agentes de biocontrole com maior capacidade de produção de enzimas micolíticas apresentem maior capacidade de controle. Assim, variantes de D. pulvinata – isolados CEN 93 (CG 774) e CEN 62 (CG 683) que apresentam potenciais de controle diferenciados foram avaliados quanto à produção de hidrolases; adicionalmente foi procedida a caracterização bioquímica de uma proteinase e a purificação parcial desta enzima, para cada isolado. Para o isolado CEN 62, houve uma melhor atividade proteinolítica com 192 h e para o isolado CEN 93, com 240 h de crescimento em meio de cultura. Após a detecção de atividade proteinolítica, estas foram investigadas quanto aos efeitos do pH e temperatura. O pH ideal foi igual a 8,0 e a temperatura ideal entre 25° e 50°C para os dois isolados de D. pulvinata. As amostras com atividade proteinolítica foram concentradas e submetidas a cromatografias de troca iônica. Os isolados CEN 62 e CEN 93 apresentaram cinco picos de proteínas e as frações com atividades proteolíticas foram reunidas, concentradas e recromatografadas em outras colunas de troca iônica e, então, seu perfil eletroforético estabelecido. Verificou-se que todas as amostras resultantes dos processos cromatográficos apresentaram mais de uma espécie protéica, demonstrando que as proteases foram purificadas apenas parcialmente. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT

The fungus Dicyma pulvinata(Deuteromycotina: Hyphomycete) shows strong biocontrol potential for plant diseases, and has been found in lesions caused in plants by Microcyclus ulei (Ascomycete), the agent of the South American Leaf Blight (SALB). This disease of the rubber tree (Hevea spp.), is a limiting factor for latex production and for expansion culture in Brazil and other countries of Latin America. The biological control of M.ulei by D. pulvinata, is currently considered as promising, because it colonizes strums of phytopathogen, preventing their sporulation and, consequently, reducing defoliation and inoculum rate reinfection. It is well accepted that hydrolytic enzymes, mainly chitinase, b- glucan and protease produced by fungi with antagonic capability hydrolyse the cell wall components of phytopathogenic fungi. It is therefore, believed that control agents with higher capacity of micolytic enzymes production show also higher capacity of biological control. So, variants of D. pulvinata – isolates CEN 93 (CG 774) and CEN 62 (CG 683) showing distinct capacity of M. ulei control were evaluated for their capacity to produce hydrolases. In addition, proteases produced by these two isolates were partially purified and characterized. The enzyme levels present in the culture filtrates indicated that the isolate CEN 62 had higher capacity of proteolytic enzymes production. The optima pH and temperature for each protease were about 8.0, and 25°C - 50°C, respectively. Ion exchange chromatographies of proteolytic enzyme samples from both isolates resulted in the separation of several protein peaks. Poliacrylamide gel electrophoresis indicated that all the protein fractions having proteolytic activity were partially purified only.