Obtenção de novas estirpes de bacillus thuringiensis Berliner patogênicas a larvas de Simuliidae e caracterização molecular de populações de simulium (chirostilbia) pertinax Kollar (Díptera : Simuliidae) no Brasil

Abstract

Os simulídeos pertencem a uma família de dipteros, Simuliidae, com ampla diversidade. Por ser um grupo recente na escala dos tempos geológicos, muitas espécies podem ser crípticas e/ ou espécies irmãs. Dentre as muitas espécies já conhecidas algumas possuem interesse econômico abrangendo as áreas médica, agrícola, veterinária e da indústria turística. Algumas espécies podem ser vetoras de agentes etiológicos causadores de doenças como o Simulium damnosum, vetor da oncocercose na África. Outras importunam o homem e animais de criação como Simulium pertinax no Brasil. Muitas dessas espécies de interesse econômico pertencem a complexos de espécies, que possuem algumas similaridades entre si. Mapear a fauna de Simullidae de um determinado lugar é importante para se tentar conhecer espécies semelhantes as espécies de interesse econômico ou ainda pra tentar incrementar as informações existentes das espécies já identificadas e nomeadas. Alguns estudos taxonômicos e de sistemática tem sido realizados para relacionar espécies próximas principalmente às de interesse para o controle. Dependendo dos resultados dos diferentes estudos essas espécies “próximas” podem ser elevadas à categoria de mesma espécie ou separadas em espécies distintas. Para essa separação é necessário o uso de chaves taxonômicas onde os caracteres morfológicos de larvas, pupas e do adulto são comparados. Algumas vezes, entretanto, somente por esses caracteres não é possível a separação dessas espécies. Com isso se faz necessário o uso de marcadores moleculares, dentre os quais, os dos genes do DNA mitocondrial. O gene COX I tem sido usado para se mapear essas espécies. No Brasil, uma das formas de controle de S. pertinax tem sido realizada com a bactéria entomopatogênica Bacillus thuringiensis subs. israelensis. Neste trabalho, de 96 estirpes isoladas a partir de amostras de solos oriundos da Amazônia duas estirpes S2271 e S2272 foram tóxicas a larvas de Simulium sp. A caracterização bioquímica e molecular das duas estirpes mostrou que ambas apresentavam amplicons correspondentes aos genes cry4A, cry4B, cry10, cry11, cyt1 e cyt2, e proteínas de 130kDa, 72kDa e 30kDa sendo compatível com as proteínas Cry4A e Cry4B (130kDa), Cry10 e Cry11 (72kDa) e Cyt1 e Cyt2 (30kDa) semelhante ao Bacillus thuringiensis israelensis, S1806, utilizado como padrão. A toxicidade das proteínas produzidas pelo B. thuringiensis israelensis foram testadas individualmente e em conjunto. Foi verificado que a proteína Cry4B apresentou maior toxicidade, no entanto, todas as toxinas juntas apresentam sinergismo, sendo, portanto a melhor forma para o controle do inseto. Exemplares de borrachudos foram coletados em 71 córregos do Distrito Federal e Goiás e foram identificados perfazendo um total de 22 espécies: Simulium dekeyseri, S. pertinax, S. serranum, S. spinibranchium, S. subpallidum, S. dinellii, S. brachycladum, S. lobatoi, S. rubrithorax, S. botulibranchium, S. inaequale, S. rappae, S. subnigrum, S. exiguum, S. anamariae, S. jujuyense, S. ochraceum, S. lutzianum, S. perflavum, S. rorotaense, S. hirtipupa, S. nigrimanum, dessas 10 espécies foram registradas pela primeira vez, na área de estudo (S. serranus, S. dinellii, S. brachycladum, S. botulibranchium, S. anamariae, S. ochraceum, S. lutzianum, S. perflavum, S. rorotaense e S. hirtipupa). Uma chave de identificação com estas espécies foi confeccionada para auxiliar estudos nestas áreas de estudo. Além disso, diferentes populações de S. pertinax identificadas nas coletas e outras, coletadas previamente em outros estados brasileiros (Pará, Mato Grosso, Rio Grande do Sul, São Paulo, Distrito Federal, Goiás e Rondônia) foram caracterizadas molecularmente através do gene Citocromo Oxidase I do DNA mitocondrial. Destas populações, três indivíduos de cada estado foram separados para o estudo intra e interpopulacional. Entre as populações e entre os indivíduos de uma mesma população de S. pertinax, não houve diferenças gênicas significativas entre estas. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT

Black flies are dipteran insects, from Simuliidae family and possess a wide diversity. Being a group in recent geologic time scale, many species are cryptic and/or sister species. Among many known species, some have economic interest, like in the medical, agricultural, veterinary and tourism industry. Some species are vectors of etiologic agents of diseases such as Simulium damnosum, vector of onchocerciasis in Africa. Others disturb the man and livestock as Simulium pertinax in Brazil. Many of these species of economic interest belong to species complexes that have some similarities. Map Simullidae fauna of a place is important to try to know the rate of similarity between species of economic interest or to try and improve the existing information of species already identified and named. Some taxonomic and systematic studies have been conducted to relate closely related species of mainly interest for the control. Depending on the results of different studies these species are "close" can be elevated to the category of the same species or separated into distinct species. For such separation is necessary to use taxonomic keys where the morphological characters of larvae, pupae and adults are compared. Sometimes, however, only through these characters is not possible to separate these species. Thus it is necessary the use of molecular markers, among which the genes of mitochondrial DNA. The COX I gene has been used to map these species. In Brazil, one of the ways to control S. pertinax has been conducted with the entomopathogenic bacterium Bacillus thuringiensis subs. israelensis. In this work, of 96 strains isolated from soil samples from the Amazon two new strains S2271 e S2272 of these bacteria were toxic to larvae of Simulium spp. The biochemical and molecular characterization of two strains showed that both had amplicons corresponding to genes cry4A, cry4B, cry10, cry11, cyt1 and cyt2, and proteins 130kDa, 72kDa e 30kDa is compatible with protein Cry4A e Cry4B (130kDa), Cry10 e Cry11 (72kDa) and Cyt1 e Cyt2 (30kDa) similar to Bacillus thuringiensis israelensis, S1806, used as standard. The toxicity of the proteins produced by B. thuringiensis israelensis was tested individually and together. It was found that protein Cry4B showed higher toxicity, however, all toxins together have synergistic toxins, making it the best way to control this insect. Samples of blackflies were collected in 71 rivers in Goiás and Distrito Federal and they were identified a total of 22 species: Simulium dekeyseri, S. pertinax, S. serranum, S. spinibranchium, S. subpallidum, S. dinellii, S. brachycladum, S. lobatoi, S. rubrithorax, S. botulibranchium, S. inaequale, S. rappae, S. subnigrum, S. exiguum, S. anamariae, S. jujuyense, S. ochraceum, S. lutzianum, S. perflavum, S. rorotaense, S. hirtipupa, S. nigrimanum, these 10 species were recorded for the first time in the study area (S. serranus, S. dinellii, S. brachycladum, S. botulibranchium, S. anamariae, S. ochraceum, S. lutzianum, S. perflavum, S. rorotaense e S. hirtipupa). An identification key to these species was made to aid research in these areas. Furthermore, different populations of S. pertinax identified in the collections and other previously collected in other Brazilian states (Pará, Mato Grosso, Rio Grande do Sul, São Paulo, Distrito Federal, Goiás e Rondônia) were characterized molecularly through mitochondrial DNA COX I gene. These populations, three individuals from each state were separated for studying intra-and inter. Among populations and among individuals within populations of S. pertinax, no genetic differences between them.