Padronização de um protocolo de PCR e Nested PCR para detecção de Listeria monocytogenes em queijos minas frescal

Abstract

O queijo tipo Minas frescal é um produto fresco caracterizado por possuir alto grau de umidade tornando-o extremamente suscetível à contaminação por diversos microrganismos, inclusive Listeria monocytogenes e diversos surtos já foram associados ao consumo de queijos frescos em todo o mundo. Neste trabalho, foi realizado um diagnóstico para detecção de L. monocytogenes utilizando três metodologias diferenciadas: ISO 11290, PCR convencional e Nested PCR, em massa de queijo tipo Minas frescal, artificialmente contaminada em tratamentos diferenciados. As amostras da massa do queijo foram analisadas em três momentos diferenciados: no dia da fabricação (Dia 0), cinco dias após a fabricação (Dia 5) e dez dias após a fabricação (Dia 10). Para avaliação das técnicas moleculares foram utilizados volumes de 1mL, 5mL e 10 mL a partir das amostras de queijo minas frescal. Os resultados obtidos demonstraram, que a PCR convencional detectou, a presença do patógeno, em no máximo, 33,3% do total das amostras e, apenas quando foram analisadas no dia 0, não ocorrendo detecção nos demais períodos, indicando baixa sensibilidade em relação às outras metodologias e a Nested PCR, apresentou frequência de detecção de 100% quando utilizado o volume de 1mL na realização da técnica nos três períodos analisados, com variações de no mínimo 66,6% nos demais tratamentos e volumes utilizados. Por outro lado, o método ISO 11290 apresentou frequência de 100% em todos os tratamentos e volumes avaliados, indicando melhor desempenho na detecção de L. monocytogenes em queijo minas frescal, em comparação com as demais metodologias. Ao considerarmos o curto prazo de validade desse tipo de alimento, a Nested PCR pode ser considerada mais adequada e, a sua utilização como uma ferramenta de diagnóstico para os Serviços de Inspeção, deve ser recomendada tendo em vista a obtenção de resultados com maior rapidez e alta frequência na detecção de L. monocytogenes, indicando sensibilidade e especificidade suficientes para a sua. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT

The Minas fresh cheese is a fresh product characterized by having high moisture content making it extremely susceptible to contamination by various microorganisms, including Listeria monocytogenes and several outbreaks have been associated with consumption of fresh cheeses in the world. In this study, we performed a diagnostic for detection of L. monocytogenes using three different methodologies: ISO 11290, conventional PCR and Nested PCR, mass Minas fresh cheese type, artificially contaminated in different treatments. Samples of the mass of cheese were analyzed at three different moments: the day of manufacture (day 0), five days after production (Day 5) and ten days after manufacture (Day 10). For evaluation of molecular techniques were used volumes of 1mL, 5mL and 10 mL from the samples of fresh cheese. The results showed that the conventional PCR detected the presence of the pathogen in up to 33.3% of total samples, and only when they were analyzed at day 0, no detection occurred in other periods, indicating low sensitivity to other methodologies and nested PCR, showed the frequency of detection of 100% when using the volume of 1mL in performing the technique in the three study periods, variations of at least 66.6% in other treatments and volumes used. Moreover, the ISO 11290 method presented frequency of 100% in all treatments and packages evaluated, indicating better performance in detecting L. monocytogenes in fresh cheese in comparison with other methodologies. In considering the short shelf life of such food, nested PCR can be considered more appropriate, and its use as a diagnostic tool for Inspection Services, should be recommended in order to obtain results more quickly and high frequency in the detection of L. monocytogenes, showing sensitivity and specificity for its implementation. .