Avaliação do citoesqueleto, padrão de atividade mitocondrial e ultraestrutura de embriões ovinos produzidos in vivo congelados ou vitrificados em etilenoglicol

Abstract

A criopreservação de embriões ovinos tem sido amplamente difundida, porém seus índices de sobrevivência e prenhez têm mostrado grande variação. Neste estudo, embriões produzidos in vivo foram congelados ou vitrificados e reaquecidos para avaliação ultraestrutural e determinação do padrão de atividade mitocondrial e integridade do citoesqueleto. Os embriões foram colhidos de ovelhas superovuladas, classificados e selecionados para criopreservação. Embriões submetidos à congelação lenta (n=22) foram exposto à solução de 0,75M de etilenoglicol (EG) por 10 minutos, 1,5M de EG por 10 minutos, acondicionados em palhetas de 0,25mL e submetidos a curva de congelação programável (-1°C/min, seeding a -7°C, 0,3°C/min até -35°C) com posterior imersão em nitrogênio líquido. Embriões vitrificados (n=24) foram submetidos à solução de 10% de EG+10% de DMSO por 1 minuto e 30 segundos, passando para a solução de 20% de EG+20% de DMSO com 0,5M de sacarose por 30 segundos acondicionados em OPS e mergulhados em nitrogênio líquido. Os embriões descongelados/reaquecidos foram cultivados por 1 hora, reclassificados em estereomicroscópio e subdivididos para avaliação. Os embriões criopreservados mostraram variável grau de desorganização de citoesqueleto e ausência de marcação para atividade mitocondrial. Foi possível correlacionar os achados anteriores com a ultraestrutura e distribuição das organelas pelo citoplasma. Embriões congelados mostraram características ultraestruturais semelhantes a embriões frescos de mesma qualidade. Embriões vitrificados apresentaram maior frequência de grandes vesículas de digestão. ________________________________________________________________________________ ABSTRACT

Cryopreservation of sheep embryos has been widespread, but their survival rate and pregnancy have shown great variation. After in vivo production sheep embryos were frozen or vitrified and processed for ultrastructural evaluation and determining the pattern of mitochondrial activity and integrity of the cytoskeleton. Embryos were collected from superovulated ewes, classified and selected for cryopreservation. Embryos subjected to slow freezing (n = 22) were exposed to 0.75 M ethylene glycol (EG) for 10 minutes, 1.5M EG for 10 minutes, packed in 0.25mL straws and subjected to programmable freezing (-1 ° C / min, seeding at -7 ° C, 0.3 ° C / min to -35 ° C) followed by immersion in liquid nitrogen. Vitrified embryos (n = 24) were placed in 10% EG +10% DMSO solution for 1 minute and 30 seconds, then in 20% EG +20% DMSO solution with 0,5M sucrose for 30 seconds packed in OPS and dipped in liquid nitrogen. The cryopreserved embryos were warmed, cultured for 1 hour, reclassified and subdivided for evaluation. Cryopreserved embryos showed variable degree of cytoskeleton disorganization and no marker for mitochondrial activity. It was possible to correlate these findings with the ultrastructure and distribution of the organelles. Frozen embryos showed ultrastructural features similar to fresh embryos of the same quality. Vitrified embryos showed a higher frequency of large digestion vesicles.