Resíduos agroindustriais com potencial para a produção de holocelulases de origem fúngica e aplicações biotecnológicas de hidrolases

Abstract

A complexidade e heterogeneidade das estruturas de holoceluloses de diferentes resíduos agrícolas requerem a ação sinérgica de enzimas para a sua completa hidrólise, envolvendo: celulase, hemicelulase e poligalacturonase. Os fungos filamentosos, Penicillium corylophilum, Aspergillus flavus, Aspergillus oryzae, Aspergillus terreus, Aspergillus awamori, Emericella nidulans, Acrophialophora nainiana, Pleurotus ostreatus, Agaricus brasiliensis e Trichoderma reesei, produzem holocelulases, quando cultivados em meios líquidos e sólidos tendo como fonte de carbono diferentes materiais lignocelulósicos, tais como engaço de bananeira, bagaço de cana-deaçúcar, resíduos do beneficiamento de algodão, resíduos da colheita de milho, entre outros. A purificação parcial em cromatografia de filtração em gel Sephacryl-200 do extrato bruto de P. corylophilum crescido piolho-de-algodão-sujo em meio líquido mostrou um pico de atividade de xilanase com 0,340 UI.mL-1. O extrato bruto de A. flavus crescido em engaço de bananeira apresentou atividades relevantes para xilanase, poligacturonase, porém teve atividade de endoglucase cinco vezes menor que o T. reesei RUT C-30. O fracionamento do extrato bruto do A. flavus (engaço de bananeira) foi realizado por membranas de ultrafiltração (PM: 300, 100, 50 e 30), mostrando multiplicidade de endoglucanase e poligacturonase. Os extratos brutos dos cultivos de A. flavus foram submetidos a um processo de purificação (ultrafiltração, cromatografia de filtração em gel e troca iônica), destacando na produção de xilanase e pectinase. O extrato bruto de A. flavus crescido em engaço de bananeira mostrou no processo têxtil de biopurga resultados semelhantes aos apresentados pelos extratos enzimáticos comerciais Denimax Acid L e Viscozyme. No entanto os processos têxteis de biopolimento e bioestonagem tiveram baixo rendimento, provavelmente em função do manchamento causado pelos pigmentos do extrato bruto e pouca atividade de endoglicanase. A. oryzae, A. terreus e E. nidulans foram isolados de compostagem natural de resíduos do rebeneficiamento de algodão, os quais apresentaram atividades relevantes de holocelulases quando crescidos em engaço de bananeira e piolho-de-algodão-sujo. A cromatografia de filtração em gel S-400 do concentrado em PM 300 do extrato bruto de E. nidulans crescido em piolho-de-algodão mostrou para atividade de 0,509 UI.mL-1 para arabinofuranosidase, como também dois picos de xilanase que foram revelados por meio de zimograma. Os cultivos de A. brasiliensis CS1, P. ostreatus H1 e A. flavus apresentaram atividades de holocelulases relevantes quando cultivados em meio sólido, nas seguintes fontes de carbono: resíduos da colheita de milho, bagaço de cana-de-açúcar e engaço de bananeira. A. oryzae, A. terreus e E. nidulans apresentaram atividades de holocelulases usando fontes de carbono lignocelulósica em cultivo líquido ou sólido, apresentando efeito de temperatura (40 a 65C) e pH diversificado (ácido, neutro e alcalino), dependendo do fungo, tipo de substrato e forma de cultivo. O perfil proteômico desses fungos variou quanto ao tipo de substrato usado como fonte de carbono, presença ou não da enzima PNGase F no gel uni e bidimensional. O fitofissionoma cerradão-floresta mostrou uma diversidade de fungos filamentosos do solo, serrapilheira ou troncos em decomposição, quando isolados em meios de cultura e temperaturas diferentes. O uso de lacases e poli-etileno-glicol 4000 junto com enzimas comerciais em hidrólise enzimática de resíduos da colheita de milho (corn stover) após o pré-tratamento deste material lignocelulósico (Liquid Hot Water – LHW) mostrou um rendimento de 20% a mais quando comparado com a mesma condição sem a presença desses aditivos. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT

The complexity and heterogeneity of structures of holocellulose from different agricultural residues demand the synergistic action of enzymes for complete hydrolysis involving cellulase, hemicellulase and polygalacturonase. The filamentous fungi Penicillium corylophilum, Aspergillus flavus, Aspergillus oryzae, Aspergillus terreus, Aspergillus awamori, Emericella nidulans, Acrophialophora nainiana, Pleurotus ostreatus, Agaricus brasiliensis and Trichoderma reesei produce holocellulases when grown on liquid and solid media containing as carbon source different lignocellulosic materials such as banana stem, sugarcane bagasse, cotton residues, and corn stover, among others. Partial purification by gel filtration chromatography on Sephacryl-200 of crude extract of P. corylophilum grown on dirty cotton residue and liquid medium showed a peak of xylanase activity with 0.340 UI.mL-1. The crude extract of A. flavus grown on banana stem showed relevant activities of xylanase and polygacturonase, although displayed an endoglucase activity five times smaller than observed from T. reesei RUT C-30. The fractionation of the crude extract of A. flavus (banana stem) was performed using ultrafiltration membranes (PM: 300, 100, 50 and 30), showing the multiplicity of endoglucanase and xylanase. Culture extracts of A. flavus underwent a process of purification (ultrafiltration, chromatography, gel filtration and ion exchange), especially in the production of xylanase and polygalacturonase. In the process of textile bioscouring, the crude extract of A. flavus grown on banana stem showed results similar to those observed with commercial enzyme extracts Denimax Acid L and Viscozyme. However, the processes of textile biostoning and biopolishing had only a low yield, probably as a result of staining by pigments. A. oryzae, A. terreus, and E. nidulans were isolated from natural waste compost-based re-beneficiation of cotton, and showed relevant activities of holocellulase when grown on banana stem and dirtycotton residue. Gel filtration chromatography in Sephacryl-400 of the crude extract of E. nidulans grown in dirty-cotton showed an arabinofuranosidase activity of 0.509 UI.mL-1, as well as two peaks of xylanase that were revealed by zymogram analysis. Cultures of A. brasiliensis CS1, P. ostreatus H1 and A. flavus showed relevant holocellulase activities when grown on solid medium containing corn crop residues, sugarcane bagasse and banana stem as carbon sources. A. oryzae, A. terreus, and E. nidulans showed holocellulase activities over varied temperatures (40-65C) and pH (acid, neutral and alkaline), depending on the substrate type and cultivation form. The proteomic profile in two dimensional gels of these fungi depended of the type of substrate used as carbon source, and the presence or absence of the enzyme PNGase F. The savanna forest phytofisionomy showed a diversity of filamentous fungi from soil, litter or decaying logs, when isolated in culture media and different temperatures. The use of laccases and poly-ethylene glycol 4000 together with commercial enzymes in the enzymatic hydrolysis of corn stover after pretreatment of lignocellulose (Liquid Hot Water - LHW) showed an increased yield of 20% when compared with the same condition without the presence of these additives.