Clonagem e expressão de uma α-amilase de Cryptococcus flavus e sua aplicação na degradação do amido.

Abstract

α-Amilases têm aplicações nas indústrias de processamento do amido, produção de álcool, têxtil e outras. Na busca por fontes de amilases na biodiversidade do cerrado, uma levedura foi isolada e classificada como Cryptococcus flavus. Embora esta levedura seja capaz de metabolizar amido, ela não pode ser usada na indústria por não possuir status GRAS. Por outro lado, S. cerevisiae, amplamente utilizada na indústria de etanol, não é capaz de degradar amido para produzir açúcares fermentescíveis, sendo necessária a clonagem e expressão heteróloga de enzimas amilolíticas nesse microrganismo. Neste trabalho, o gene da amilase de C. flavus (AMY1) codificando uma amilase extracelular foi clonado e expresso com sucesso em S. cerevisiae. A seqüência de nucleotídeos do cDNA revelou uma ORF de 1896 pb codificando uma cadeia polipeptídica de 631 aminoácidos apresentando uma homologia (97%) com a amilase da levedura Cryptococcus sp S-2. A presença das quatro regiões conservadas, (I) 144DVVVNH149, (II) 235GLRIDSLQQ243, (III) 263GEVFN267 e (IV) 327FLENQD332 classificou essa enzima na família 13 das glicosil hidrolases (G13). A cinética de produção da amilase recombinante alcançou a atividade amilolítica máxima (3,93 U/mL) em 60 horas de cultivo. A proteína recombinante apresentou uma massa molecular similar a amilase nativa (~ 67 kDa), parte devido à N-glicosilação. Além disso, a amilase recombinante foi caracterizada bioquimicamente apresentando um pH ótimo de 5,5, temperatura ótima de 60 °C e Km= 0,37 mg/mL para o amido. Com o objetivo de desenvolver uma cepa de S. cerevisiae capaz de degradar o amido de forma mais eficiente, o gene da glicoamilase de Aspergillus awamori foi clonado no vetor YEp352-PGK para co-expressão com o gene da amilase de C. flavus, clonado previamente no vetor YEp351-PGK. O clone de S. cerevisiae expressando as duas enzimas foi capaz de crescer em meio contendo amido como única fonte de carbono. Dados preliminares de fermentação em frasco mostraram que esse clone é capaz de produzir 116 g de ethanol/L durante 120 horas de cultivo. _____________________________________________________________________________ ABSTRACT

α-Amylases have applications in starch processing, alcohol production, textile and others industries. On screening for amylolytic yeasts in the Brazilian Cearrado, a yeast was isolated and classified as Cryptococcus flavus. Although C. flavus is able to metabolize starch, it cannot be used in industry because it does not possess GRAS status. On the other hand, S. cerevisiae, which is widely used in ethanol industry, cannot degrade starch to fermentable sugars, requiring for that the cloning and heterologous expression of amylolytic enzymes from other microrganisms. In this work, a C. flavus α-amylase gene (AMY1) encoding an extracelullar α-amylase has been cloned and successfully expressed in S. cerevisiae. The nucleotide sequence of the cDNA revealed an ORF of 1896 pb coding for a 631 amino acid polypeptide with high identity (97%) to a homologous protein isolated from Cryptococcus sp S-2. The presence of four conserved regions, (I) 144DVVVNH149, (II) 235GLRIDSLQQ243, (III) 263GEVFN267 and (IV) 327FLENQD332, places the enzyme in the GH13 α-amylase family. The assessment of the time course of amylase secretion in S. cerevisiae revealed a maximal extracellular amylolytic activity (3.93 U/mL) at 60 hours of incubation. The recombinant protein had an apparent molecular mass similar to the native enzyme (~67 kDa), part of which was due to N-glycosylation. On further characterization it was found that the recombinant amylase has optimal activity on pH 5.5 at 60 °C. Its for starch is Km= 0.37 mg/mL . In order to develop a S. cerevisiae strain able to degrade starch more efficiently, the Aspergillus awamori glucoamylase gene was cloned into the YEp352-PGK vector with a view to co-expression with the C. flavus α-amylase gene, previously cloned into YEp351-PGK. This new strain expressing both enzymes was able to grow in medium containg starch as sole carbon source. Preliminary data of flask fermentation suggest that this strain is able to produce 116g ethanol/L in 120 h of incubation.