Clonagem e estudo da expressão do gene da mio-Inositol 3-Fosfato Sintase (MIPS) em maracujazeiro (Passiflora edulis Sims f. flavicarpa Degener)

Abstract

A mio-inositol-1L-fosfato sintase (MIPS) é a enzima responsável pela conversão de D-glucose 6-fosfato a 1-L-mio-inositol-1-fosfato, primeiro e limitante passo na via de síntese de todos os compostos derivados do inositol. Os inositol-fosfolipídios, assim como outros compostos derivados do inositol, têm um papel fundamental no tráfico de membrana e rotas de sinalização, estocagem e transporte de auxinas, biossíntese de ácido fítico e parede celular, e produção de moléculas relacionadas ao estresse. No presente trabalho, nós caracterizamos um cDNA do gene MIPS de sementes de Passiflora edulis f. flavicarpa (PeMIPS1) e investigamos a sua expressão espacial, bem como mudanças na transcrição em plantas submetidas ao estresse causado pelo frio e calor Para estas análises, uma seqüência do cDNA do gene MIPS foi isolada por PCR (5e 3RACE) e os níveis dos transcritos foram analisados usando RT-PCR semi-quantitativo durante o desenvolvimento da semente, óvulo, grão-de-pólen, folha, caule, pétala, glândula foliar e em resposta ao estresse. A seqüência completa do cDNA do gene PeMIPS foi isolada, clonada e caracterizada. Adicionalmente, o número de cópias do gene PeMIPS clonado foi determinado por análise de Southern blot no genoma de Passiflora edulis, Passiflora eichleriana, Passiflora caerulea, Passiflora nitida e Passiflora coccinea. Esta análise indicou que o DNA genômico pode conter diversas seqüências de outros genes MIPS, mas uma única cópia do gene PeMIPS clonado foi encontrado no genoma de P. edulis, P. eichleriana, P. caerulea, P. nitida e P. coccinea. A análise da expressão por RT-PCR revelou a presença de transcritos de PeMIPS em óvulos, grãos-de-pólen, folhas e durante os estágios do desenvolvimento da semente, com um pico nove dias após a polinização. Verificou-se ainda, que o gene PeMIPS é diferencialmente regulado sob condições de estresse causado pelo frio e calor em resposta à presença ou ausência de luz. Portanto, o presente trabalho sugere que o PeMIPS tem um importante papel no estabelecimento de programas de desenvolvimento e na resposta das plantas à mudanças ambientais. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT

Myo-inositol-1L-phosphate synthase (MIPS) catalyses the conversion of D-glucose 6-phosphate to 1-L-myo-inositol-1-phosphate, the first and rate-limiting step in the biosynthesis of all inositol-containing compounds. Inositol phospholipids play a vital role in membrane trafficking and signalling pathways, auxin storage and transport, phytic acid biosynthesis, cell wall biosynthesis, and production of stress-related molecules. In the present study, we characterised an MIPS cDNA from developing Passiflora edulis f. flavicarpa (PeMIPS1) seeds and investigated its spatial and differential expression, as well as changes in its transcription during exposure of growing plants to cold and heat stresses. MIPS encoding gene was isolated by PCR methods and the transcript levels were examined using semi-quantitative RT-PCR during seed development, ovules, pollen grains, stem, leaves, petals, leaf gland and in response to heat and cold stress. In addition, the copy number of the cloned PeMIPS gene in the genome of Passiflora edulis, Passiflora eichleriana, Passiflora caerulea, Passiflora nitida and Passiflora coccinea was determined by Southern blot analyses. Full-length cDNA clone of the PeMIPS1 from P. edulis was isolated and characterised. Southern blot analyses indicated that the genomic DNA might have diverse sequences of MIPS-encoding genes and one copy of the cloned PeMIPS1 gene in the genomes of P. edulis, P. eichleriana, P. caerulea, P. nitida and P. coccinea. RT-PCR expression analyses revealed the presence of PeMIPS1 transcripts in ovules, pollen grains and leaves, and during the seed developmental stages, where it was observed a transcriptional peak at the ninth days after pollination. The PeMIPS1 gene is differentially regulated under cold- and heat-stress, presenting a light-responsive transcription. Experimental data suggest that PeMIPS1 plays an important role in the establishment of developmental programs and during the response of plants to environmental changes. The PeMIPS1 is differentially regulated during cold and heat stress, presenting a light-response pattern, indicating that the extension of the inositol pathway is an important aspect for environmental stress response.