Farmacologia do Receptor do Hormônio Tiroidiano, Nova mutação no sítio de "splicing" do gene do hormônio luteinizante e Determinação da atividade da Luciferase : um novo método para medida in vitro de interação proteína-proteína

Abstract

Os hormônios tireoideanos (HTs) são necessários para a diferenciação, crescimento e metabolismo de diversos tecidos de mamíferos. Seus efeitos são mediados pelos receptores do hormônio tireoideano (TRs), que pertencem à superfamília dos receptores nucleares. Os TRs são fatores de transcrição que se ligam ao DNA nos promotores dos genes alvos, em regiões denominadas de elementos responsivos ao TR (TRE). Para modular a atividade transcricional (repressão ou ativação) TR se interage com correpressores e co-ativadores, na ausência e na presença de T3, respectivamente. Para melhor se entender a relação entre estrutura e função do TR, investigamos o papel da isoleucina 280 na interação deste com o correpressor SMRT e com os coativadores SRC1 e GRIP. Para isso utilizamos TRs mutantes onde a isoleucina 280 foi substituída por uma arginina (I280R), metionina (I280M), ou lisina (I280K). A atividade transcricional destes mutantes foi avaliada nos elementos responsivos positivos (DR4, F2, e TREpal) por ensaio de gene repórter luciferase e a interação com os correguladores pelo ensaio de interação proteína-proteína em solução (GST “pull down”). Além disso, utilizamos o mutante F451X, descrito na síndrome de resistência ao HT, pois esse receptor se interage avidamente aos correpressores. Nossos resultados demonstraram que os mutantes I280K e I280R foram transcricionalmente inativos em DR4, F2 e TREpal. Por outro lado, quando comparado ao TR􀁅1 selvagem, a mutação I280M não modificou a atividade transcricional em DR4, F2 e TREpal. Adicionalmente, a diferença observada nas capacidades transcricionais de I280M, I280R, e I280K em DR4, F2 e TREpal correlacionou-se com a capacidade de se interagir com os coativadores, pois, apenas o mutante I280M foi capaz de se ligar ao GRIP e ao SRC1 de forma semelhante ao TR selvagem. Além disso, I280M, I280K e I280R apresentaram uma diminuição na capacidade de se interagir o correpressor SMRT e a introdução da mutação I280R no F451X aboliu a alta capacidade de ligação deste mutante ao correpressores. Para completa compreensão das diferenças entre I280M, I280R, e I280K testamos a capacidade de ligação ao T3 pelo ensaio de ligação ao T3-I125. Observamos que a mutação I280M reduz discretamente a afinidade do T3 ao TR􀁅1, enquanto que as mutações I280R e I280K abole a ligação do T3 ao TR􀁅1. Assim, I280R e I280K além de impedir a ligação os correpressores impedem também à ligação ao hormônio, o que não ocorre com o I280M. Por outro lado, I280M, I280R e I280K se heterodimerizaram com RXR de forma semelhante ao TR selvagem. Diante dessas observações, para melhor compreensão do mecanismo molecular envolvido na repressão mediada por T3, avaliamos a atividade transcricional dos mutantes I280R, I280M, I280K, F451X e I280R/F451X sobre alguns promotores regulados negativamente como: Colagenase-1, Hormônio liberador de tirotropina (TRH) e Superóxido dismutase 1 (SOD-1). A soma dos nossos achados demonstra que, de forma geral, nesses promotores, na ausência de T3, TR estimula a transcrição e que essa ativação é de alguma forma dependente da interação com os correpressores. Por outro lado, a repressão da transcrição mediada por T3, depende da manutenção da superfície de interação com os coativadores. Em conclusão, as diferenças nos resultados observados em nossos mutantes parece ser secundária às diferenças existentes entre as cadeias laterais dos aminoácidos isoleucina, arginina, lisina e metionina (Isoleucina e metionina possuem cadeia lateral hidrofóbica, arginina e lisina possuem cadeias laterais polares e carregadas positivamente). O resíduo I280 está localizado na superfície de ligação ao correpressor, não faz contato direto com o co-ativador, em outros receptores nucleares seu correspondente é sempre de resíduos hidrofóbicos (isoleucina, Leucina, Valina, Metionina) e aparentemente tem a função de interagir com aminoácidos da face interna da H12. Dessa forma, as cadeias laterais carregadas positivamente pelos aminoácidos lisina e arginina poderiam impedir a sustentação da H12 em sua posição correta o que, conseqüentemente, impedir a formação da superfície de ligação aos co-ativadores e também diminuir a afinidade pelo ligante. Além disso, nos promotores regulados negativamente, na ausência de T3, a ativação da transcrição por TR depende da manutenção da superfície de interação com correpressores, enquanto que a repressão da transcrição mediada por T3 exige a preservação da interface de interação do TR com os coativadores. ___________________________________________________________________________________ ABSTRACT

The Thyroid hormones (THs) are necessary for differentiation, growth and metabolism of various mammals tissues. Its effects are mediated by thyroid hormone receptors (TRs) that belong to the nuclear receptors superfamily. The TRs are transcription factors that bind to DNA in the promoters of target genes, in regions called the TR-responsive elements (TRE). To modulate transcriptional activity (repression or activation) TR interacts with correpressores and co-activators, in the absence and presence of T3, respectively. To better to understand the relationship between structure and function of TR, we investigated the role of isoleucine 280 in the TR interaction with the correpressor SMRT and the coactivators SRC1 and GRIP. TRs mutants where the isoleucine 280 has been replaced by an arginine (I280R), methionine (I280M) or lysine (I280K) were created. The transcriptional activity of these mutants were assessed in positive responsive elements (DR4, F2, and TREpal) by luciferase reporter gene assay, and the interaction with the correguladores were assessed by GST pull down assays. Furthermore, we use the mutant F451X, described in the syndrome of resistance to TH, because this receptor interacts eagerly to correpressores. Our results showed that the mutants I280K and I280R were transcriptionally inactive in DR4, F2 and TREpal. Furthermore, when compared TR􀁅1 wild type, the mutation I280M not changed the transcriptional activity in DR4, F2 and TREpal. Additionally, the difference observed in the transcriptional capacity of I280M, I280R and I280K in DR4, F2 and TREpal correlated with the ability to interact with coactivators, therefore only the mutant I280M was able to connect to GRIP and the SRC1 in a manner similar to the TR wild type. Moreover, I280M, I280K and I280R showed a decrease in the ability to interact correpressor SMRT and the introduction of the mutation I280R in F451X abolished the high binding capacity of this mutant to corepressors. To complete understanding of the differences between I280M, I280R and I280K we tested the ability to bind to T3. We observed that the mutation I280M slightly reduces the affinity to T3, while the mutations I280R and I280K abolishing the bind to T3. So I280R and I280K addition to prevent the TR binding to corepressors, also prevent the binding to the hormone, which is not the case with the I280M. Moreover, I280M, I280R and I280K heterodimerization with RXR was similar to the TR wild type. Given these observations, for the better understanding of the molecular mechanism involved in the repression mediated by T3, we assessed the transcriptional activity of the mutant I280R, I280M, I280K, F451X and I280R/F451X in some promoters negatively regulated by T3 as: Collagenase-1, thyrotropin releasing hormone (TRH) and Superoxide dismutase-1 (SOD-1). The sum of our findings show that, in general, these promoters, in the absence of T3, TR stimulates transcription activation and this is somehow dependent on the interaction with correpressores. Moreover, the transcription repression mediated by T3, depends on the maintenance of the coactivator interaction surface. In conclusion, differences in the results seen in our mutants appears to be secondary to differences between the amino acids side chains isoleucine, arginine, lysine and methionine (Isoleucine and methionine have hydrophobic side chains, arginine and lysine have polar and positively charded side chains). The residue I280 is located on the corepressor binding surface, it makes direct contact with the corepressors, in other nuclear receptors its correspondent is always hydrophobic (isoleucine, Leucine, Valine, Methionine), and apparently has the task of interacting with amino acids from the inner surface of H12. Thus, positively charded side chain amino acids lysine and arginine might prevent support of H12 in its correct position, which, therefore, prevent the formation of coactivator binding surface and also decrease the affinity for the ligand. Moreover, the negatively regulated promoters, in the absence of T3, and the TR transcription activation depends on the maintenance of the corepressor interaction surface, while the T3 mediated transcription repression requires the maintenance of the coactivators interaction surface.