Desenvolvimento de circuitos genéticos mediados por serina-integrases: memória permanente e modulação de genomas procariontes e eucariontes

Abstract

A capacidade de regular a expressão de genes em resposta a sinais externos é um dos mecanismos centrais envolvidos na manutenção da vida na natureza, sendo também um dos principais objetivos de cientistas no esforço para controlar e reprogramar organismos. Para tal, ferramentas que permitam a manipulação gênica são cruciais na biologia sintética, especialmente na criação de circuitos genéticos complexos e redes regulatórias sintéticas. Serina-integrases (Ints) são importantes candidatos devido a suas propriedades, como a capacidade de executar suas funções sem necessidade de auxiliares endógenos. Além disso, a depender do desenho de seus sítios de reconhecimento (sítios att), a edição pode resultar em diferentes tipos de rearranjos, como inserção, excisão ou inversão. Considerando as vantagens advindas de sua plasticidade de uso e robustez, neste trabalho apresentamos a aplicação de Ints na construção de circuitos genéticos integrados aos genomas de dois modelos de graus de complexidade distintos: Mycoplasma mycoides JCVI-syn3B, uma bactéria de genoma procariótico minimizado sinteticamente, e Nicotiana benthamiana, um importante modelo vegetal com genoma eucariótico complexo. Em M. mycoides JCVI-syn3B, Int9 e Int13 foram inicialmente avaliadas como efetores de interruptores genéticos capazes de inverter a sequência codificadora de um gene repórter. Apenas a ativação por Int9 resultou no aumento de expressão do repórter, sendo então selecionada como ativador para um segundo interruptor responsável por controlar a expressão da endonuclease I-CeuI, usada na digestão e consequente deleção do genoma celular para produção de Simple Cells (SimCells), uma importante plataforma para aplicações em biologia sintética. O uso do interruptor controlado por Int9 permitiu um fino controle de expressão da nuclease. Por fim, para elaboração de um sistema kill-switch que permita a seleção negativa de escapes do processo de remoção do genoma, promotores induzíveis foram testados, com apenas o promotor pA13/AraE-AraR apresentando o comportamento esperado, porém com níveis de expressão muito baixos. Já para N. benthamiana um sistema mais complexo foi desenhado. Nomeado Int-Plex@ (Integrase- Plant Expression), o sistema consiste no gene repórter mgfp flanqueado por sítios att das integrases Bxb1, phiC31, Int9 e Int13, podendo ser dividido em dois módulos: inversão e excisão. O primeiro é composto pelos sítios att de Int9 e Int13, com sua recombinação resultando em uma inversão do DNA alvo e expressão de mGFP. A ativação com as duas Ints resultará no retorno do gene repórter à sua orientação inicial. Já o módulo de excisão é ativado por Bxb1 ou phiC31. Sua ativação leva à remoção irreversível da sequência de DNA flanqueada por seus sítios att. Todas as Ints testadas foram capazes de editar o genoma de N. benthamiana. O sistema Int-Plex@ poderá futuramente ser aplicado na modulação de vias metabólicas vegetais de interesse econômico ou ambiental, endereçando questões de biocontenção de transgenes, dada a possibilidade de excisão da construção. Somando aos esforços de avanço em biologia sintética, o trabalho incluiu a implementação de metodologias de produção e uso de sistema de expressão in vitro (TxTl) e encapsulamento para geração de sistemas sintéticos, incluindo a comprovação de funcionamento do sistema Int-Plex@ no sistema TxTl.