Caracterização funcional e estrutural de peptídeos antimicrobianos sintéticos Grammistinas hibridizados com motivos de ligação metálica ATCUN

Abstract

O aumento do número de microrganismos patogênicos multirresistentes é atribuído ao uso errôneo de antibióticos comerciais, sendo essencial buscar e desenvolver novas drogas antimicrobianas. Os peptídeos antimicrobianos (PAMs) têm despertado interesse devido às suas propriedades promissoras como alternativas aos antibióticos convencionais, atuando diretamente nas membranas bacterianas ou em alvos intracelulares. Apesar das vantagens, aspectos físico-químicos dos PAMs podem limitar suas aplicações terapêuticas. Estratégias de desenho racional podem ser empregadas para otimizar esses peptídeos e gerar agentes antimicrobianos mais potentes e seguros. Desta forma, o presente estudo teve como objetivo propor, sintetizar, purificar e caracterizar química e biologicamente dois novos peptídeos análogos de Grammistinas modificados com o motivo ATCUN e comparar seu ganho de potência com os peptídeos selvagens. A síntese dos peptídeos foi realizada em fase sólida empregando-se química Fmoc,seguida de purificação por cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa (CLAE-FR). Por meio de estudos conformacionais in vitro e in sílico, foi possível observar que os peptídeos apresentam estrutura em alfa-hélice na presença de SDS 35 mM e TFE 50%, com ausência de face hidrofóbica e carga líquida +2. Os peptídeos demonstraram ser bastante efetivos na inibição do crescimento da bactéria Gram-positiva Staphylococcus aureus e sua variante resistente com valores de CIM variando entre 4 μM e 16 μM, para ambos os peptídeos. Dos peptídeos análogos sintetizados, apenas um apresentou ganho de potência na presença de Cu +2 que foi o peptídeo ATCUN-Pp2a, onde bactérias Gram-negativas como Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae e Pseudomonas aeruginosa resistentes apresentaram valores de CIM mais baixos para o mesmo peptídeo sem a presença de Cu+2 . Análises por microscopia de varredura eletrônica demonstraram que os peptídeos antimicrobianos estudados afetam a membrana da bactéria S. aureus ATCC 25923, ocasionando aberturas, rugosidades, formação de fragmentos e, em alguns casos, destruição completa de membrana. Os peptídeos apresentaram uma moderada atividade hemolítica, onde apenas o peptídeo ATCUN-Pp2a apresentou hemólise acima de 50% na dose de 16 μM. Os peptídeos também demonstraram atividade citotóxica sobre linhagens tumorais como HeLa e MCF-7, bem como sobre a linhagem não-tumoral HaCaT, com valores de IC50 variando entre 10,74 μM e 51,52 μM. Os ensaios de citometria de fluxo demonstraram que os neutrófilos, quando na presença dos peptídeos, não produziram espécies reativas de oxigênio, no entanto, apenas um dos peptídeos demonstrou uma diferença significativa (p<0,05) nesse ensaio. De maneira geral, os peptídeos não estimularam ação migratória sobre os neutrófilos, porém GsD-Wild Type demonstrou uma sutil atividade migratória quando comparada ao controle negativo. Os peptídeos GsD-Wild Type, Pp2a-Wild Type e ATCUN-GsD interferiram com a capacidade quimioatraente do fMLP. Em resumo, os peptídeos estudados possuem atividade contra certas bactérias, especialmente as resistentes, e têm efeitos bactericidas e imunomoduladores em neutrófilos. Eles podem influenciar os estágios iniciais da infecção e afetar certos tipos de câncer, mas também podem ser citotóxicos para células não-tumorais.