Desenvolvimento de linhagens de Komagataella phaffii contendo novos sistemas de controle da expressão gênica livres de metanol

Abstract

Komagataella phaffii (anteriormente conhecida como Pichia pastoris) é uma levedura considerada como uma das mais importantes plataformas disponíveis para produção de proteínas e metabólitos em larga escala da atualidade, devida a sua alta produtividade e fácil controle dos parâmetros fermentativos. Sua característica fisiológica mais distinta é a capacidade de usar metanol como fonte única de carbono graças à hiperexpressão do gene AOX1 que codifica para a enzima peroxissomal álcool oxidase 1. O promotor PAOX1 permite a alta expressão com controle finamente regulado pela concentração de metanol, o que o tornou o sistema de expressão recombinante mais utilizado neste organismo. No entanto, a maior limitação deste sistema no contexto de bioprocessos industriais é o fato do metanol ser altamente tóxico e inflamável. Faz-se necessário o desenvolvimento de um sistema de indução da expressão gênica baseado em um agente indutor atóxico, preferencialmente não consumido pela célula, a fim de diminuir os custos de produção em larga escala. Neste trabalho foram testados dois mecanismos de controle de expressão: à nível transcricional, pelo sistema GAL proveniente de S. cerevisiae buscando a indução da produção da proteína recombinante fluorescente verde (GFP) sob controle do promotor PGAL1 regulado por galactose e o sistema de controle de expressão a nível traducional utilizando um riboswitch controlado por tetraciclina buscando inibir a produção das proteínas β-galactosidase e Ku70p. Os resultados demonstraram sucesso na utilização do riboswitch como mecanismo de controle da produção de proteína em K. phaffii com fácil aplicação e potencial grande impacto na aplicação deste sistema em larga escala.