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Título : Uso de metodologia CRISPR/dCas9 para identificação de transferência gênica horizontal entre parasito e hospedeiro : aplicação na infecção por Trypanosoma cruzi
Autor : Ferreira, Tatiana Shiroma Borges
Orientador(es):: Hecht, Mariana Machado
Assunto:: Transferência gênica horizontal
Minicírculos de kDNA
Trypanosoma cruzi
Fecha de publicación : 3-sep-2024
Citación : FERREIRA, Tatiana Shiroma Borges. Uso de metodologia CRISPR/dCas9 para identificação de transferência gênica horizontal entre parasito e hospedeiro - aplicação na infecção por Trypanosoma cruzi. 2023. 70 f., il. Dissertação (Mestrado em Patologia Molecular) — Universidade de Brasília, Brasília, Brasília, 2023.
Resumen : A transferência gênica horizontal (TGH) tem um papel importante na plasticidade evolutiva dos organismos para novos ambientes e condições, podendo ser favorecida por diversas relações ecológicas, como o parasitismo. Exemplos convincentes de TGH têm sido demonstrados em diferentes parasitos e hospedeiros, como é o caso da transferência de minicírculos de kDNA de Trypanosoma cruzi para o genoma hospedeiro, preferencialmente em regiões de retroelementos LINE-1. Nesse sentido, várias metodologias são utilizadas para inferir a presença de TGH entre organismos não relacionados, cada uma com seu próprio conjunto de características e limitações. Recentemente, técnicas de marcação fluorescente passaram a ser empregadas para verificar a integração e localização de genes candidatos a TGH no genoma do hospedeiro. Assim, vários estudos já utilizaram o sistema CRISPR/dCas9 (Cas9 desativada), ligado a proteína verde fluorescente (GFP – Green Fluorescent Protein), para investigar a organização e dinâmica cromossômica e visualizar loci genômicos. Embora nenhum estudo ainda tenha utilizado a técnica para detectar eventos TGH, o sistema mostra-se promissor para tal, uma vez que possibilita avaliar a organização espaço-temporal dessas sequências no genoma. Neste trabalho, demonstramos a TGH na relação parasito-hospedeiro por metodologia CRISPR/dCas9, utilizando como modelo células infectadas pelo T. cruzi. Inicialmente, a técnica foi validada com diversos controles, o que mostrou especificidade de marcação e ausência de alvos inespecíficos. Nos grupos experimentais, células HEK-293 infectadas pelo parasito apresentaram pontos fluorescentes no núcleo, em diferentes períodos analisados, quando transfectadas com RNA guia (gRNA) para sequência de kDNA (gkDNA). Ainda, demonstramos que a transferência de kDNA independe da presença do parasito, uma vez que a transfecção com gkDNA detectou alvos no genoma de células tratadas com benznidazol e de células cocultivadas com o parasito em sistema transwell. Além disso, nossos dados mostram que a infecção pelo T. cruzi aumenta a expressão de retroelementos LINE-1. Em contraste, células transfectadas com gRNA para LINE-1 e posteriormente infectadas tiveram a expressão desses retroelementos reprimida em quase 80%. Os resultados obtidos neste trabalho demonstram que o sistema CRISPR/dCas9 foi capaz de identificar sequência de DNA proveniente de evento TGH no modelo de estudo. Os achados dão suporte ao uso da técnica como metodologia complementar na identificação e estudo de sequências transferidas horizontalmente entre diferentes organismos.
Abstract: Horizontal gene transfer (HGT) plays an important role in the evolutionary plasticity of organisms to new environments and conditions, and may be favored by several ecological relationships, such as parasitism. Convincing examples of HGT have been demonstrated in different parasites and hosts, as is the case of the transfer of Trypanosoma cruzi kDNA minicircles to the host genome, preferentially in regions of LINE-1 retroelements. In this sense, several methodologies are used to infer the presence of HGT among unrelated organisms, each with its own set of characteristics and limitations. Recently, fluorescent labeling techniques have been used to verify the integration and localization of HGT candidate genes in the host genome. Thus, several studies have already used the CRISPR/dCas9 system (Cas9 deactivated), linked to GFP, to investigate chromosomal organization and dynamics and visualize genomic loci. Although no study has yet used the technique to detect HGT events, the system shows promise for this, since it makes it possible to evaluate the space-time organization of these sequences in the genome. In this work, we demonstrate lateral gene transfer in the host-parasite relationship using the CRISPR/dCas9 methodology, using T. cruzi-infected cells as a model. Initially, the technique was validated with several controls, which showed labeling specificity and absence of nonspecific targets. In the experimental groups, HEK-293 cells infected by the parasite showed fluorescent spots in the nucleus, at different periods analyzed, when transfected with guide RNA (gRNA) for the kDNA sequence (gkDNA). Furthermore, we demonstrate that kDNA transfer does not depend on the presence of the parasite, since gkDNA transfection detected targets in the genome of cells treated with benznidazole and cells co-cultured with the parasite in the transwell system. Furthermore, our data show that T. cruzi infection increases the expression of LINE-1 retroelements. In contrast, cells transfected with LINE-1 gRNA and later infected had the expression of these retroelements repressed by almost 80%. The results obtained in this work demonstrated that the CRISPR/dCas9 system was able to identify the DNA sequence from the HGT event in the study model. The findings support the use of the technique as a complementary methodology in the identification and study of horizontally transferred sequences between different organisms.
metadata.dc.description.unidade: Faculdade de Medicina (FMD)
Descripción : Dissertação (mestrado) — Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2023.
metadata.dc.description.ppg: Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular
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Agência financiadora: Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), Fundação de Apoio à Pesquisa do Distrito Federal (FAP/DF) e Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq).
Aparece en las colecciones: Teses, dissertações e produtos pós-doutorado

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