Implementação de um sistema de marcação proteômica organelar por proximidade baseado em APEX2 para glicossomos e núcleos de tripanossomatídeos

Abstract

Os tripanossomatídeos, pertencentes à classe Kinetoplastida e incluindo os gêneros Trypanosoma e Leishmania, são agentes causadores de doenças tropicais negligenciadas que impactam mais de 1,7 bilhão de pessoas em todo o mundo, conforme relatado pela OMS em 2023. Estes parasitos possuem características biológicas únicas, como organelas especializadas e núcleos com uma composição proteica peculiar, diferenciando-os notavelmente de outros eucariotos. Entre as organelas especializadas, o glicossomo se destaca pela diversidade de seu repertório enzimático, essencial para processos metabólicos como a via das pentoses-fosfato, gliconeogênese, via de salvamento de purina, β-oxidação de ácidos graxos e biossíntese de éterlipídios, isoprenóides, esteróis e pirimidinas. As enzimas glicossomais, fundamentais nessas vias, são alvos promissores para o desenvolvimento de medicamentos. No entanto, até o momento, as análises do proteoma dessas organelas foram abordadas por meio de métodos convencionais de enriquecimento, que resultam em uma cobertura limitada das proteínas identificadas. Para superar essa limitação, os métodos de marcação por proximidade têm sido amplamente aplicados para o mapeamento proteômico de diferentes compartimentos subcelulares. Dessa forma, o objetivo desse estudo foi elaborar uma estratégia de marcação de proximidade baseada em APEX2 para analisar a composição proteica dos glicossomos e do núcleo de Leishmania infantum e Trypanosoma cruzi. Inicialmente, procedemos com a clonagem da sequência da APEX2, que foi fusionada ao peptídeo de endereçamento glicossômico (PTS1) e ao sinal de localização nuclear (NLS), nos vetores pLEXSY (Leishmania) e pTREX (T. cruzi), adquiridos comercialmente. Paralelamente, como controle, realizamos a clonagem da sequência de mNeonGreen, também fusionada aos mesmos peptídeos. Essa estratégia resultou na criação de um total de oito construções distintas. Após transfecção dos plasmídeos e seleção dos parasitos resistentes à marca de seleção, os diferentes clones foram avaliados quanto à sua expressão e atividade. Os resultados indicaram que as proteínas APEX2 estão abundantemente expressas nos extratos proteicos de ambos os parasitos transfectados com o cassete. Contudo, em relação às proteínas mNeonGreen, observou-se uma expressão reduzida nos extratos proteicos examinados. Adicionalmente, as proteínas APEX2- PTS1 e APEX2-NLS promoveram a biotinilação específica de proteínas nos glicossomos e no núcleo, respectivamente, em L. infantum. Esses resultados revelam a possível viabilidade da aplicação da APEX2 no contexto bioquímico de L. infantum. Como perspectiva, visamos validar a técnica em T. cruzi e realizar uma análise proteômica comparativa entre os dois organismos. Acreditamos que essa abordagem nos permitirá revelar mecanismos de adaptação metabólica empregados por esse grupo de parasitos, além de identificar possíveis alvos farmacológicos para o tratamento das doenças associadas a tripanossomatídeos.