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Título: Efeito do Atazanavir, da Curcumina e do Lopinavir nas vias canônica e não canônica do NF-kB determinantes de resposta inflamatória em neuroblastoma SK e em células mononucleares do sangue periférico de gestantes incubadas in vitro com o vírus Zika
Autor(es): Oliveira, Mariangela Souza de
Orientador(es): Junqueira, Maria Imaculada Muniz Barboza
Assunto: Inibidores de protease
Zika vírus
Atazanavir
Curcumina
Lopinavir
Microcefalia
Mulheres grávidas
Neuroblastoma
Citocinas
Data de publicação: 3-Set-2024
Referência: OLIVEIRA, Mariangela Souza de. Efeito do Atazanavir, da Curcumina e do Lopinavir nas vias canônica e não canônica do NF-kB determinantes de resposta inflamatória em neuroblastoma SK e em células mononucleares do sangue periférico de gestantes incubadas in vitro com o vírus Zika. 2023. 216 f., il. Tese (Doutorado em Patologia Molecular) — Universidade de Brasília, Brasília, Brasília, 2023.
Resumo: INTRODUÇÃO: O vírus Zika é um flavivírus que pode causar microcefalia em humanos. O fator de transcrição nuclear NF-κB regula a inflamação, a sobrevida celular e a resposta imune, e é ativado pelas vias canônica ou não canônica. O atazanavir, curcumina e lopinavir têm mostrado efeitos moduladores sobre o NF-B, podendo interferir na progressão das respostas imunes das células mononucleares do sangue periférico (CMSP) de gestantes e de neuroblastomas (NB). OBJETIVO: O objetivo desse trabalho foi avaliar o efeito do atazanavir, curcumina e lopinavir nas vias canônica e não canônica do NF-κB, e a produção de citocinas e quimiocinias em células de NB e em CMSP de gestantes e não gestantes, incubadas in vitro com o Zika. MATERIAIS E MÉTODOS: Avaliou-se os efeitos da incubação in vitro com o Zika e do tratamento com o atazanavir, curcumina e lopinavir na expressão dos receptores para o TNF (rLTX, r1TNF e r2TNF) e das moléculas da via do NF-B em NB e CMSP de não gestantes e gestantes. A produção de citocinas inflamatórias e imunológicas foi quantificada por citometria de fluxo. Os grupos de estudo foram: Controle, incubados com o Zika, tratados com atazanavir, tratados com atazanavir e incubados com o Zika, tratados com curcumina, tratados com curcumina e incubados com o Zika, tratados com lopinavir e tratados com lopinavir e incubados com o Zika. A adsorção do Zika foi feita após 30 min de incubação das células e os tratamentos iniciaram após 1 h de adsorção do vírus, permanecendo em tratamento por 6 h. Foram avaliados os receptores para linfotoxina (rLTX) e receptores para o TNF (r1TNF e r2TNF), as moléculas FADD, TRAF, NIK, JNK, IB, p50, p52, p65 relA, relB e c-Rel nas células de NB e monócitos, além das citocinas imunes e inflamatórias: TNF, IFN-γ, IL-12p70, IL-2, IL-10, IL-4, IL-17A, IL-8 e IL-1 nos sobrenadantes das culturas dos NBs e CMSP; e as quimiocinas: CXCL8/IL-8, RANTES, CXCL9/MIG, CCL2/MCP-1; CXCL10/IP-10 nos sobrenadantes das culturas das CMSP. As analises foram feias pelos testes de ANOVA ou Kruskal-Wallis, ANOVA para medidas repetidas ou Friedamn, teste t ou MannWhitney, segundo as indicações e significante para p<0,05. RESULTADOS: Observou-se partículas do Zika no citoplasma dos NB por microscopia eletrônica de transmissão. O atazanavir inibiu o crescimento do Zika entre 6 e 24 horas após a incubação, a curcumina reduziu o crescimento do vírus nas primeiras 6 horas após a incubação e o lopinavir reduziu o crescimento do vírus entre os primeiros períodos após a infecção. O NB apresentou constitutivamente no grupo controle maior expressão do rLTX. Nos grupos incubados apenas com o Zika, e os grupos atazanavir+zika, curcumina, curcumina+zika, lopinavir e lopinavir+zika houve maior expressão do r2TNF. Nos monócitos, as não gestantes apresentaram em todos os grupos maior expressão do r1TNF e as gestantes o rLTX. No NB, a molécula FADD foi mais expressa que a molécula TRAF em todos os grupos, sendo c-Rel a de maior expressão das moléculas finais da via. No controle (basal), o NB expressou constitutivamente o rLTX, FADD, NIK, IkB e c-Rel, com produção de IL-8 e IL-6. Nas não gestantes, o r1TNF foi o de maior expressão e nas gestantes, o rLTX, como também a produção de IL-6, IL-8, IL-1β, TNF e as quimiocina MCP-1 e RANTES. Na incubação com o Zika, houve maior expressão do c-Rel nos NBs e menor expressão de relB, com produção aumentada de IL-8 e IL-6. Nas CMSP houve maior expressão do relA em não gestantes, e maior produção de IL-8, TNF, MCP-1 e nas gestantes, maior produção de IL-8, IL-6, TNF e IL1β. No tratamento com o atazanavir, nos NBs, o c-Rel continuou mais expresso, porém notou-se aumento na expressão da molécula p52, com redução de IL-6, mantendo os níveis de IL-8. Nos monócitos, as não gestantes apresentaram maior expressão da p52, e nas gestantes, maior expressão do relA, com aumento na produção de IL-8. No grupo atazanavir+zika, para os NBs, o c-Rel continuou a ser a molécula mais expressa, porém, houve aumento do p52 e nos monócitos, o relA foi mais expresso nas não gestantes e gestantes, com aumento de IL-8 e IL-1β. No tratamento com a curcumina, o c-Rel foi mais expresso pelo NB, com aumento da molécula p52 e do relA e redução da IL-6 e IL-8 e nos monócitos, as gestantes e não gestantes expressaram relA. No grupo curcumina+Zika, os NBs expressaram o c-Rel, relA e p52 e os monócitos relA, em não gestantes, que aumentaram IL-8 e IL-1β, e em gestantes, que produziram mais IL-6, IL-8 e IL-1β. No tratamento com o lopinavir, os NBs expressaram mais c-Rel, com redução de IL-6 e as gestantes continuaram a expressar o relA mais elevado. No grupo lopinavir+Zika, os NBs expressaram c-Rel e p52 e nas CMSP, as gestantes aumentaram o relA e IL-8. CONCLUSÕES: Confirmamos que o Zika infecta os NBs. O atazanavir, a curcumina e o lopinavir apresentaram uma ação direta reduzindo o crescimento do Zika. A ativação do NF-B foi sugestiva da via não canônica nos NB e nos monócitos de gestantes, por expressarem o rLTX, porém as moléculas ativadas juntamente com esse receptor, mostraram um perfil que tende para a via canônica e a incubação com o vírus mostrou que os NBs tendem a uma resposta pelo r2TNF, com perfil canônico. Os monócitos de não gestante expressaram o r1TNF, com ou sem infecção viral, o que sugere uma resposta canônica. As citocinas detectadas e que também sofreram variação têm perfil de ativação canônico. As drogas não afetaram o tipo de resposta, mas atuaram na intensidade responsiva das células. Nossos dados indicam que todas as drogas estudadas foram promissoras e particularmente o atazanavir, que causou uma importante inibição do crescimento do Zika, e deve ser melhor avaliada pela possibilidade de reaproveitamento para o tratamento precoce da infecção pelo Zika, para evitar a microcefalia.
Abstract: INTRODUCTION: The Zika virus is a flavivirus that can cause microcephaly in humans. The nuclear transcription factor NF-κB regulates inflammation, cell survival, and immune response, and is activated by canonical or non-canonical pathways. Atazanavir, curcumin, and lopinavir have shown modulatory effects on NF-κB, which can interfere with the progression of immune responses of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from pregnant women and neuroblastomas (NB). OBJECTIVE: The objective of this study was to evaluate the effect of atazanavir, curcumin, and lopinavir on the canonical and non-canonical pathways of NF-κB, and the production of cytokines and chemokines in NB cells and PBMCs from pregnant and non-pregnant women, incubated in vitro with the Zika virus. MATERIALS AND METHODS: The effects of in vitro incubation with Zika and treatment with atazanavir, curcumin, and lopinavir on the expression of TNF receptors (rLTX, r1TNF and r2TNF) and molecules of the NF-κB pathway in NB and PBMC of pregnant and non-pregnant women were evaluated. The production of inflammatory and immunological cytokines was quantified by flow cytometry. The study groups were: Control, incubated with Zika, treated with atazanavir, treated with atazanavir and incubated with Zika, treated with curcumin, treated with curcumin and incubated with Zika, treated with lopinavir, and treated with lopinavir and incubated with Zika. The adsorption of Zika was performed after 30 min of cell incubation, and treatments began after 1 h of virus adsorption, remaining in treatment for 6 h. The following were evaluated: receptors for lymphotoxin (rLTX) and TNF receptors (r1TNF and r2TNF), FADD, TRAF, NIK, JNK, IκB, p50, p52, p65 relA, relB, and c-Rel molecules in NB cells and monocytes, as well as immune and inflammatory cytokines: TNF, IFN-γ, IL-12p70, IL-2, IL-10, IL-4, IL-17A, IL-8, and IL-1 in the supernatants of NB and PBMC cultures; and chemokines: CXCL8/IL-8, RANTES, CXCL9/MIG, CCL2/MCP-1; CXCL10/IP-10 in the supernatants of PBMC cultures. The analyses were performed by ANOVA or Kruskal-Wallis tests, repeated measures ANOVA or Friedman, t-test or Mann-Whitney, according to the indications and significant for p<0.05. RESULTS: Particles of Zika were observed in the cytoplasm of NB by transmission electron microscopy. Atazanavir inhibited the growth of Zika between 6 and 24 h after incubation, curcumin reduced virus growth in the first 6 h after incubation, and lopinavir reduced virus growth between the first periods after infection. NB constitutively presented higher expression of rLTX in the control. In groups incubated only with Zika, and atazanavir+zika, curcumin, curcumin+zika, lopinavir, and lopinavir+zika there was higher expression of r2TNF. In monocytes, nonpregnant women presented higher expression of r1TNF in all groups, and pregnant women presented higher expression of rLTX. In NB, the FADD was more expressed than the TRAF in all groups, with c-Rel being the molecule with the highest expression of the final pathway. In the control (basal), NB constitutively expressed rLTX, FADD, NIK, IκB, and c-Rel, with production of IL-8 and IL-6. In non-pregnant women, r1TNF had the highest expression, and in pregnant women were rLTX, as well as IL-6, IL-8, IL-1β, TNF, and the chemokines MCP-1 and RANTES. In incubation with Zika, there was higher expression of c-Rel in NBs and lower expression of relB, with increased production of IL-8 and IL-6. In PBMC, there was higher expression of relA in non-pregnant women, and higher production of IL-8, TNF, MCP-1, and in pregnant women, higher production of IL-8, IL-6, TNF, and IL1β. In treatment with atazanavir, in NBs, cRel was more expressed, but an increase in the expression of the molecule p52 was noted, with a reduction in IL-6, while maintaining the levels of IL-8. In monocytes, non-pregnant presented higher expression of p52, and pregnant presented higher expression of relA, with an increase in the production of IL-8. In the atazanavir+zika group, for NBs, c-Rel was the most expressed, however, there was an increase in p52 and in monocytes, relA was more expressed in non-pregnant and pregnant, with an increase in IL-8 and IL-1β. In the treatment with curcumin, c-Rel was more expressed by NB, with an increase in the p52 and relA and a reduction in IL-6 and IL-8, and in monocytes, pregnant and non-pregnant women expressed relA. In the curcumin+Zika group, NBs expressed c-Rel, relA, and p52, and monocytes expressed relA, in non-pregnant women, which increased IL-8 and IL-1β, and in pregnant women, which produced more IL-6, IL-8, and IL-1β. In treatment with lopinavir, NBs expressed more c-Rel, with a reduction in IL-6, and pregnant women continued to express the highest relA. In the lopinavir+Zika group, NBs expressed c-Rel and p52, and in CMSP, pregnant women increased relA and IL-8. CONCLUSIONS: It was confirmed that Zika virus infects NBs. Atazanavir, curcumin, and lopinavir showed a direct action in reducing Zika growth. The activation of NF-κB was suggestive of the non-canonical pathway in NB and monocytes of pregnant women, as they expressed rLTX, but the molecules activated along with this receptor showed a profile that tends towards the canonical pathway, and incubation with the virus showed that NBs tend to respond through r2TNF, with a canonical profile. Non-pregnant women's monocytes expressed r1TNF, with or without viral infection, suggesting a canonical response. The detected cytokines that also varied have a canonical activation profile. The drugs did not affect the type of response but acted on the responsive intensity of the responses of the cells. Our data indicate that all the drugs studied were promising, and particularly atazanavir, which caused significant inhibition of Zika virus growth, and it should be better evaluated for the possibility of repurposing for early treatment of Zika infection to avoid microcephaly.
Unidade Acadêmica: Faculdade de Medicina (FMD)
Informações adicionais: Tese (doutorado) — Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2023.
Programa de pós-graduação: Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular
Licença: A concessão da licença deste item refere-se ao termo de autorização impresso assinado pelo autor com as seguintes condições: Na qualidade de titular dos direitos de autor da publicação, autorizo a Universidade de Brasília e o IBICT a disponibilizar por meio dos sites www.unb.br, www.ibict.br, www.ndltd.org sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o texto integral da obra supracitada, conforme permissões assinaladas, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data.
Agência financiadora: Fundação de Apoio à Pesquisa do Distrito Federal (FAP/DF) e Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq).
Aparece nas coleções:Teses, dissertações e produtos pós-doutorado

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