Análise in sílico e produção da apirase recombinante de Rhodnius Prolixus

Abstract

A Doença de Chagas (DC) é causada pelo protozoário flagelado Trypanosoma cruzique é transmitido entre hospedeiros por triatomíneos (Hemiptera: Reduviidae). A DC é uma doença negligenciada e endêmica nas Américas. Na saliva de triatomíneos são encontradas moléculas que contrapõem a hemostasia e modulam o sistema imune do hospedeiro. As apirases são moléculas que catabolizam nucleotídeos e nucleosídeos e interferem na agregação plaquetária mediada por ADP. Rhodnius prolixus é um importante vetor/transmissor da DC. Os objetivos deste estudo foram realizar uma análise in sílico das apirases de R. prolixus e produzir as proteínas recombinantes em sistema heterólogo de expressão procarioto. Duas sequências deapirases de R. prolixus (T1H8D6 e T1H852) foram caracterizadas in sílico, clonadas no vetor de expressão Pet17b (Novagen) e fusionadas com cauda 6xHis para expressão em sistema bacteriano utilizando a linhagem de bactérias Escherichia coliBL21(DE3). Após a transformação, seleção e cultivo dos clones bacterianos, SDS-PAGE e Western blotting foram realizados para confirmar a expressão das apirases recombinantes de R. prolixus. A atividade apirásica foi avaliada em solução e por zimografia. Das duas apirases de R. prolixus, apenas a proteína T1H8D6 de aproximadamente 40 kDa foi expressa. A proteína recombinante foi observada somente na fração insolúvel sob a forma de agregados celulares, formando corpos de inclu são. Os corpos de inclusão foram preparados e purificados por cromatografia de afinidade. As sequências de aminoácidos das apirases de R. prolixus possuem sítios para N-glicosilação, O-glicosilação, acetilação, fosforilação e presença de um peptí deo sinal. Além disso, a análise comparativa entre os modelos das apirases de R. prolixus com membros das famílias CD39, 5’ nucleotidase e Cimex mostrou que elas possuem similaridade com a família Cimex, as quais são dependentes de Ca2+ para a sua atividade no catabolismo de nucleotídeos. As apirases facilitam a hematofagia através da inibição da agregação plaquetária mediada por ADP no hospedeiro vertebrado e seu estudo pode auxiliar no desenvolvimento de abordagens para prevenir a transmissão da DC.