Exploring relevant features of colorectal cancer from clinical and biological data : a bioinformatics approach

Abstract

O câncer colorretal (CRC) é um dos tipos de câncer mais comuns e letais em todo o mundo, sendo o segundo câncer mais comum no Brasil [1]. O CRC é um câncer heterogêneo, que se instala na parte inferior do intestino grosso e pode ser classificado de acordo com seu campo anatômico, como câncer de cólon, de reto ou na junção retossigmoide. O tipo mais frequente de CRC é o adenocarcinoma, que corresponde a 90% dos casos. A maioria das mortes causadas por CRC acontece quando esse entra em estado de metástase. No entanto, se detectado em seus estágios iniciais, a sobrevida do paciente com CRC pode melhorar consideravelmente. Esta doença pode ser influenciada por diversos aspectos ambientais, tais como: hábitos alimentares, idade e peso. Normalmente, o tratamento recomendado para pacientes com CRC é a cirurgia para sua remoção e, depois, o uso de quimioterapia, porém o tratamento pode diferir de acordo com seu campo anatômico. O diagnóstico do CRC em um campo anatômico incorreto pode levar o médico a prescrever um tratamento não recomendado ao paciente, o que pode afetar a sua taxa de mortalidade. Para auxiliar o prognóstico, prevenção e tratamento de CRC, é fundamental entender os mecanismos moleculares e os indicadores clínicos que afetam o desenvolvimento do CRC. Quanto aos aspectos biológicos do CRC, podemos descrever o impacto dos RNAs codificadores e não-codificadores nos mecanismos subjacentes à doença. Em específico, podemos destacar três moléculas: RNAs longos não codificadores (em inglês, long non-coding RNAs - lncRNAs), micro RNAs (miRNAs) e RNAs mensageiros (em inglês, messenger RNAs - mRNAs). Nos eucariotos, os mRNAs maduros são formados a partir do prémRNA que, por sua vez, é produzido a partir do processo de transcrição passar por um processo conhecido como excisão (em inglês, splicing), que remove algumas regiões (íntrons) do pré-mRNA e liga outras regiões (exons), formando assim o mRNA maduro. O processo de splicing possibilita gerar mais de uma proteína a partir de um único gene, em um processo conhecido como excisão alternativa (em inglês, alternative splicing. Por sua vez, as proteínas coordenam quase todos os processos vitais no organismo, sendo utilizadas em reações metabólicas e afetando diversos processos biológicos, como o desenvolvimento de doenças. Os miRNAs desempenham um papel essencial na expressão gênica, mais especificamente, ligando-se aos mRNAs e iniciando os processos de inibição ou degradação de seu alvo. Por sua vez, os lncRNAs não estão diretamente presentes neste processo de regulação da expressão de mRNA, mas desempenham papéis essenciais no organismo, como a alteração das funções de outras moléculas e, assim, afetam a expressão de proteínas indiretamente, o que pode contribuir para o surgimento e supressão de doenças. Considerando o papel específico de cada uma das moléculas descritas no desenvolvimento de doenças, estudos recentes destacaram a importância de um mecanismo conhecido como redes de RNAs endógenos concorrentes (em inglês, competing endogenous RNAs - ceRNAs), nos quais os lncRNAs, os miRNAs e os mRNAs interagem entre si. Nesse mecanismo, os miRNAs, que se ligam aos mRNAs pelos binding sites, podem também se ligar aos ceRNAs, assim, regulando indiretamente a expressão dos mRNAs. A identificação de redes ceRNA relacionadas ao surgimento do CRC e seus mecanismos subjacentes podem auxiliar os médicos a entender melhor a doença e realizar um melhor prognóstico do paciente. Na literatura, podemos encontrar alguns estudos que usam abordagens baseadas em bioinformática para criar redes ceRNAs e auxiliar a identificação de biomarcadores para o câncer de cólon, reto e o câncer colorretal em geral. Embora alguns estudos tenham foco na construção de redes ceRNA, até onde sabemos, nosso estudo foi o primeiro a estabelecer redes ceRNAs específicas para: (i) cólon; (ii) reto; e (iii) junção retossigmóide, além de relacioná-los com mecanismos biológicos específicos, a fim de esclarecer as diferenças e fatores comuns entre essas diferentes localizações anatômicas. Por outro lado, alguns estudos sugerem o uso de métodos de aprendizagem de máquina e também o uso de características clínicas para predizer marcadores que podem ser usados para prognóstico de pacientes com CRC [9, 10, 11]. Especificamente, Gründner et al. [9] sugeriram um método que combina características biológicas e clínicas para predizer marcadores de prognóstico de pacientes com CRC na África do Sul. Esses estudos descreveram bons resultados obtidos a partir de modelos de predição. Tanto quanto saibamos, nosso estudo foi o primeiro que usou dados abertos e métodos de aprendizagem de máquina para predizer a reincidência de CRC e a sobrevivência do paciente usando marcadores biológicos extraídos de redes ceRNAs de câncer de cólon, de reto e na junção retossigmoide, combinados com características clínicas. Nesta tese, na primeira etapa, propusemos um pipeline utilizando dados de livre acesso de pacientes com CRC, extraídos do banco de dados The Cancer Genome Atlas (TCGA), para construir redes ceRNAs específicas para o CRC e marcadores biológicos que afetam o prognóstico do paciente. Nosso objetivo foi o de realizar uma análise para identificar moléculas que possam ser usadas como marcadores biológicos para os três sítios anatômicos do CRC, cólon, reto e junção retossigmoide. Para construir tais redes e propor os marcadores biológicos, a expressão de RNA e os dados clínicos dos pacientes com CRC foram coletados. Os perfis de expressão de RNA foram produzidos por meio de ferramentas de análise que utilizam técnicas de bioinformática. Em seguida, encontramos redes ceRNA específicas para cada campo anatômico, para as quais, como dados de saída, obtivemos as redes ceRNA e as moléculas nelas presentes. Após essa etapa, foi realizada uma análise funcional, onde identificamos potenciais vias metabólicas relacionadas ao surgimento de câncer, as quais têm participação das moléculas obtidas na etapa anterior. Finalmente, uma análise de sobrevida global para identificar o impacto dessas moléculas no prognóstico do paciente foi realizada, resultando em uma lista de potenciais marcadores biológicos. Nessa etapa, ficaram evidenciados diversos potenciais biomarcadores que afetam o prognóstico do paciente em câncer de cólon, de reto e na junção retossigmoide. Além disso, redes ceRNA específicas para cada campo anatômico foram construídas, e foram identificadas diferentes vias biológicas que destacam diferenças no comportamento do CRC nos diferentes campos anatômicos, reforçando assim, a importância de identificar corretamente o campo anatômico em que o tumor ocorre. Como resultados, geramos um grupo de potenciais biomarcadores biológicos que afetam o prognóstico do CRC, em particular, podemos destacar: hsa-miR-1271-5p, NRG1, hsa-miR-130a-3p, SNHG16 e hsa-miR-495-3p para câncer de cólon; E2F8 para câncer retal; e DMD e hsa-miR-130b-3p para câncer na junção retossigmoide. Com a lista de potenciais marcadores biológicos que podem afetar no prognóstico de CRC, prosseguimos para a segunda etapa desta tese, em que propusemos um pipeline para prever a reinicindiva do CRC e a sobrevida dos pacientes, utilizando métodos de aprendizagem de máquina supervisionados. Fatores clínicos, como idade e peso, assim como fatores biológicos, podem afetar o prognóstico e o surgimento do CRC. Para melhor entender os mecanismos do CRC e identificar o impacto, tanto dos fatores clínicos, quanto dos fatores biológicos em seu prognóstico, usamos as características clínicas do paciente combinadas com os marcadores biológicos encontrados no passo anterior, como características biológicas, para treinar nossos modelos. Para alcançar um maior desempenho na predição e na possibilidade de interpretação dos resultados propostos, avaliamos e comparamos os seguintes algoritmos de aprendizagem de máquina: Random Forest - RF, Logistic Regression - LR, Support Vector Machine - SVM, K-Nearest Neighbors - KNN, Decision Tree - DT e Adaptative Boosting - AB. Para encontrar a importância de cada característica durante a construção dos modelos de predição, primeiro foi realizada uma análise de seleção de características, para filtrar e classificar quais dessas características de fato tinham impacto no modelo de predição construído. Com essas características biológicas e clínicas relevantes selecionadas, construímos os modelos de aprendizagem de máquina e avaliamos seu desempenho. Finalmente, como resultado, geramos modelos de aprendizagem de máquina para prever a reincidência do CRC e a sobrevivência do paciente, e uma lista de potenciais características biológicas e clínicas relevantes para o prognóstico do paciente. Nesta etapa, identificamos diversos potenciais marcadores biológicos e clínicos como importantes na reincindiva do CRC e na sobrevida do paciente. Quanto à importância das características, identificamos: SNHG16, hsa-miR-130b-3p, hsa-miR-495-3p e KCNQ1OT1 como características biológicas; e idade, etnia, estágio patológico, quimioterapia, altura e peso, contagem positiva de linfonodos e contagem de linfonodos como características clínicas. Finalmente, usando LR e RF, alcançamos uma precisão de 90% e 82% para predição da sobrevivência do paciente e da reincidiva do CRC, respectivamente. Além disso, o uso dos seis algoritmos de apredizagem de máquina propostos mostrou um bom desempenho geral, em específico, o RF apresentou bons resultados, o que também foi destacado em outros estudos [9, 10, 11]. Por fim, a pesquisa desenvolvida neste tese mostrou que o uso de técnicas de bioinformática em conjunto com o uso de algoritmos de aprendizagem de máquina pode melhorar a interpretação dos mecanismos presentes no CRC. No entanto, devemos destacar alguns fatores limitantes com os quais nos deparamos, como a quantidade de dados disponíveis para pacientes com câncer de junção rectosigmoide e a especificidade regional dos dados clínicos dos pacientes, visto que o banco de dados utilizado continha informações principalmente de pacientes dos Estados Unidos. Perspectivas de uso dos métodos desenvolvidos nesta tese são, primeiro, os pipelines propostos poderiam fornecer aos médicos um entendimento melhor dos mecanismos subjacentes ao CRC em seus diferentes campos anatômicos. Além disso, nossos modelos poderiam ser usados para auxiliar na predição de prognóstico do paciente. Por fim, executar esses pipelines com dados de pacientes brasileiros poderia ajudar os médicos a entender melhor as características específicas no surgimento do CRC e prognóstico dos pacientes que vivem nas diferentes regiões do Brasil.