Análise metagenômica-biológica da diversidade de vírus da família Geminiviridae e de agentes subvirais em cultivares de tomateiro suscetíveis e tolerantes (Ty-1/Ty-3) em diferentes regiões brasileiras

Abstract

A cultura do tomateiro (Solanum lycopersicum L.) possui grande importância para agricultura nacional e internacional. Diversas viroses podem acometer a cultura causando impactos negativos consideráveis. Dentre os vírus que infectam o tomateiro, as espécies classificadas no gênero Begomovirus (família Geminiviridae) merecem destaque (Capítulo 1). Os begomovírus possuem genoma de DNA circular fita simples que pode ser monopartido ou bipartido e são separados em dois grupos: begomovírus do Velho Mundo e do Novo Mundo. A transmissão dos begomovírus ocorre por meio de um complexo de espécies crípticas de Bemisia tabaci (Aleyrodidae: Hemiptera) com o predomínio de B. tabaci Middle East Asia Minor 1 – MEAM 1 (= biótipo B) e B. tabaci Mediterranean – MED (= biótipo Q). A gama de plantas hospedeiras dos begomovírus é ampla, incluindo dicotiledôneas cultivadas e não cultivadas. Há uma grande diversidade de espécies de begomovírus já descritas e diversas novas espécies vêm sendo caracterizadas na última década. A grande diversidade observada nos begomovírus é gerada por três mecanismos distintos: mutação, recombinação e pseudorecombinação. No Brasil, uma das estratégias promissoras para controle de begomoviroses no tomateiro tem sido o uso de cultivares com dois fatores de resistência/tolerância (Ty–1 e Ty–3). Com a crescente diversidade de espécies, o uso de ferramentas tais como High-Throughput Sequencing (HTS) tem permitido estudos mais amplos nesse tópico. Estudos prévios têm indicado que cultivares portadoras do gene Ty–1 reduzem o número de espécies de begomovírus que infectam o tomateiro e impactam a frequência e predominância destes vírus, agindo como um ‘filtro biológico’. Além disto, espécies novas e/ou recombinantes podem superar fatores de tolerância presentes na planta hospedeira. Dessa maneira, o objetivo deste trabalho foi realizar o monitoramento e caracterização via sequenciamento com tecnologia HTS da diversidade viral da família Geminiviridae e de agentes subvirais associados ao gênero Begomovirus junto ao cultivo do tomateiro em cinco regiões geográficas do Brasil entre 2003–2017. Para tanto, 154 amostras de tomateiros sintomáticos (com e sem os fatores Ty–1 e Ty–3) foram coletadas em cinco regiões brasileiras: Norte (13 amostras), Nordeste (36), Sul (24), Sudeste (39) e Centro-Oeste (42). As amostras foram enriquecidas com DNA circulares por meio de Rolling Circle Amplification (RCA). As amostras enriquecidas foram agrupadas em dois pools: BP1 (amostras das regiões Norte, Nordeste e Sul) e BP2 (Sudeste e Centro-Oeste) e submetidas ao sequenciamento HTS pela plataforma Illumina NovaSeq-6000 (Capítulo 2). As sequências foram montadas em contigs utilizando o software CLC genomics Workbench 7.5, analisadas no Geneious R11.1, comparadas com o banco de sequências depositadas no GenBank por meio do algoritmo BLASTn. Do sequenciamento do pool BP1 recuperou-se 16 sequências correspondentes a 16 vírus, sendo 15 deles classificados no gênero Begomovirus, dos quais 11 correspondem a relatos de espécies já conhecidas e quatro corresponderam a potenciais novos begomovírus (espécie nova #1; espécie nova #2; espécie nova #3 e espécie nova #4), além de uma espécie de Topilevirus. Recuperou-se do sequenciamento do pool BP2 14 sequências correspondentes a 14 vírus, sendo uma provável nova espécie de begomovírus (espécie nova #5) e também sequências de alfassatélites associados aos begomovírus. Primers espécie-específicos foram empregados para recuperação dos genomas por PCR em cada amostra individualmente. Os genes Ty–1 e Ty–3 impactaram a diversidade viral e o número de amostras infectadas, sendo que as amostras desprovidas desses fatores apresentam maior número de espécies detectadas e infecções. As frequências de infecções mistas também foram maiores em amostras de tomateiros que não possuíam os fatores Ty–1/Ty–3. No capítulo 3, a recuperação por ensaios de PCR com primers espécies-específicos permitiu a detecção do begomovírus bipartido tomato chlorotic mottle Guyane virus – ToCMoGV, até então ausente no Brasil, na amostra denominada AM–035, coletada em Iranduva, estado do Amazonas, norte do Brasil. Análises moleculares e reconstruções filogenéticas demonstraram que ToCMoGV detectado no Brasil, consiste em uma estirpe com alta divergência do isolado da Guiana Francesa, com a qual o DNA–A compartilha 92% de identidade nucleotídica. No capítulo 4, através da caracterização molecular, reconstrução filogenética e análises de identidade por meio do Sequence Demarcation Tool (SDT) demonstrou-se que isolados virais depositados no GenBank identificados como tomato yellow spot virus (ToYSV) e Leonurus mosaic virus (LeMV) somados aos isolados de ToYSV recuperados por HTS no presente estudo se mostravam intimamente relacionados. Alguns compartilhavam os mesmos iterons e identidades iguais e/ou superiores a 91%, levando a concluir que foram erroneamente nomeados uma vez que se trata de uma única espécie viral. Esse vírus ocorre apenas esporadicamente no tomateiro, mas é o patógeno predominante em Leonurus. Neste contexto, foi elaborada uma proposição de que apenas a nomenclatura original/mais antiga (Leonurus mosaic virus) seja empregada para esse patógeno. O Capítulo 5 relata a detecção de um novo isolado de begomovírus infectando tomateiro na região norte do Brasil. O novo isolado de begomovírus foi detectado na amostra TO–083, originária de Araguaína, estado do Tocantins. O novo isolado é bipartido e clones infectivos foram produzidos e inoculados em tomateiros. A caracterização molecular do novo isolado identificou o iteron GGTGT/ACACC e o domínio da Rep relacionado ao iteron (Rep– IRD): MPRQPTTFRL. O isolado TO–083 foi então denomidado tomato golden leaf spot virus (ToGLSV). No capítulo 6, duas novas espécies de begomovírus monopartidos foram recuperadas por PCR com primers específicos. A nova espécie #1 foi detectada no nordeste brasileiro, nas amostras: CE–001, originária do estado do Ceará, PE–011 e PE–012, ambas de Pernambuco. A nova espécie #2 foi detectada nas amostras PR–173 e PR–174 ambas coletadas no estado do Paraná, sul do Brasil. As análises de recombinação demonstraram que as duas novas espécies são recombinantes envolvendo segmentos genômico de outros begomovírus previamente reportados infectando o tomateiro no Brasil. O begomovírus correspondente a nova espécie #1, nomeado tomato iridescent mottle virus (ToIMoV) está filogeneticamente mais próxima do tomato interveinal chlorosis virus (ToICV) (JF803252), enquanto que o tomato iridescent apical mosaic virus (ToIAMV), correspondente à nova espécie #2 está mais próxima do tomato mottle leaf curl virus (ToMoLCV) (MT215005). O capítulo 7 relata a detecção e caracterização molecular de um novo begomovírus bipartido (tomato bright apical mosaic virus –ToBAMV) infectando tomateiros, o qual foi detectado na região centro-oeste do Brasil. ToBAMV foi detectado em amostras de tomateiro oriundas do estado de Goiás (GO) e do Distrito Federal (DF), apresenta o segmento DNA–A de 2561 nucleotídeos (nts) e o DNA– B de 2527 nts. Este vírus está filogeneticamente mais relacionado com tomato golden vein virus (TGVV) (MN928612) com o qual compartilha 89% de identidade nucleotídica. As análises detectaram um evento de recombinação com tomato leaf curl purple vein virus (ToLCPVV) e tomato chlorotic mottle virus (ToCMoV). Estudos para a caracterização biológica dessa nova espécie bipartida serão realizados futuramente. O número crescente de espécies de begomovírus associadas com tomateiro que foram descritas aqui representam um grande desafio para o manejo e controle genético desse complexo de patógenos. O capítulo 8 compila os principais resultado desta tese, trazendo dados que fornece ao melhoramento genético do tomateiro, um panorama mais preciso sobre espécies de Geminiviridae que apresentam relevância epidemiológica no Brasil.