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Please use this identifier to cite or link to this item: http://repositorio.unb.br/handle/10482/49153
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Title: Análise metagenômica-biológica da diversidade de vírus da família Geminiviridae e de agentes subvirais em cultivares de tomateiro suscetíveis e tolerantes (Ty-1/Ty-3) em diferentes regiões brasileiras
Authors: Oliveira, Izaías Araújo de
Orientador(es):: Carvalho, Rita de Cássia Pereira
Coorientador(es):: Boiteux, Leonardo Silva
Assunto:: Tomate - cultivo
Vírus de plantas
Melhoramento genético
Resistência
Brasil
Issue Date: 24-Jul-2024
Citation: OLIVEIRA, Izaías Araújo de. Análise metagenômica-biológica da diversidade de vírus da família Geminiviridae e de agentes subvirais em cultivares de tomateiro suscetíveis e tolerantes (Ty-1/Ty-3) em diferentes regiões brasileiras. 2024. 196 f., il. Tese (Doutorado em Fitopatologia) — Universidade de Brasília, Brasília, 2024.
Abstract: A cultura do tomateiro (Solanum lycopersicum L.) possui grande importância para agricultura nacional e internacional. Diversas viroses podem acometer a cultura causando impactos negativos consideráveis. Dentre os vírus que infectam o tomateiro, as espécies classificadas no gênero Begomovirus (família Geminiviridae) merecem destaque (Capítulo 1). Os begomovírus possuem genoma de DNA circular fita simples que pode ser monopartido ou bipartido e são separados em dois grupos: begomovírus do Velho Mundo e do Novo Mundo. A transmissão dos begomovírus ocorre por meio de um complexo de espécies crípticas de Bemisia tabaci (Aleyrodidae: Hemiptera) com o predomínio de B. tabaci Middle East Asia Minor 1 – MEAM 1 (= biótipo B) e B. tabaci Mediterranean – MED (= biótipo Q). A gama de plantas hospedeiras dos begomovírus é ampla, incluindo dicotiledôneas cultivadas e não cultivadas. Há uma grande diversidade de espécies de begomovírus já descritas e diversas novas espécies vêm sendo caracterizadas na última década. A grande diversidade observada nos begomovírus é gerada por três mecanismos distintos: mutação, recombinação e pseudorecombinação. No Brasil, uma das estratégias promissoras para controle de begomoviroses no tomateiro tem sido o uso de cultivares com dois fatores de resistência/tolerância (Ty–1 e Ty–3). Com a crescente diversidade de espécies, o uso de ferramentas tais como High-Throughput Sequencing (HTS) tem permitido estudos mais amplos nesse tópico. Estudos prévios têm indicado que cultivares portadoras do gene Ty–1 reduzem o número de espécies de begomovírus que infectam o tomateiro e impactam a frequência e predominância destes vírus, agindo como um ‘filtro biológico’. Além disto, espécies novas e/ou recombinantes podem superar fatores de tolerância presentes na planta hospedeira. Dessa maneira, o objetivo deste trabalho foi realizar o monitoramento e caracterização via sequenciamento com tecnologia HTS da diversidade viral da família Geminiviridae e de agentes subvirais associados ao gênero Begomovirus junto ao cultivo do tomateiro em cinco regiões geográficas do Brasil entre 2003–2017. Para tanto, 154 amostras de tomateiros sintomáticos (com e sem os fatores Ty–1 e Ty–3) foram coletadas em cinco regiões brasileiras: Norte (13 amostras), Nordeste (36), Sul (24), Sudeste (39) e Centro-Oeste (42). As amostras foram enriquecidas com DNA circulares por meio de Rolling Circle Amplification (RCA). As amostras enriquecidas foram agrupadas em dois pools: BP1 (amostras das regiões Norte, Nordeste e Sul) e BP2 (Sudeste e Centro-Oeste) e submetidas ao sequenciamento HTS pela plataforma Illumina NovaSeq-6000 (Capítulo 2). As sequências foram montadas em contigs utilizando o software CLC genomics Workbench 7.5, analisadas no Geneious R11.1, comparadas com o banco de sequências depositadas no GenBank por meio do algoritmo BLASTn. Do sequenciamento do pool BP1 recuperou-se 16 sequências correspondentes a 16 vírus, sendo 15 deles classificados no gênero Begomovirus, dos quais 11 correspondem a relatos de espécies já conhecidas e quatro corresponderam a potenciais novos begomovírus (espécie nova #1; espécie nova #2; espécie nova #3 e espécie nova #4), além de uma espécie de Topilevirus. Recuperou-se do sequenciamento do pool BP2 14 sequências correspondentes a 14 vírus, sendo uma provável nova espécie de begomovírus (espécie nova #5) e também sequências de alfassatélites associados aos begomovírus. Primers espécie-específicos foram empregados para recuperação dos genomas por PCR em cada amostra individualmente. Os genes Ty–1 e Ty–3 impactaram a diversidade viral e o número de amostras infectadas, sendo que as amostras desprovidas desses fatores apresentam maior número de espécies detectadas e infecções. As frequências de infecções mistas também foram maiores em amostras de tomateiros que não possuíam os fatores Ty–1/Ty–3. No capítulo 3, a recuperação por ensaios de PCR com primers espécies-específicos permitiu a detecção do begomovírus bipartido tomato chlorotic mottle Guyane virus – ToCMoGV, até então ausente no Brasil, na amostra denominada AM–035, coletada em Iranduva, estado do Amazonas, norte do Brasil. Análises moleculares e reconstruções filogenéticas demonstraram que ToCMoGV detectado no Brasil, consiste em uma estirpe com alta divergência do isolado da Guiana Francesa, com a qual o DNA–A compartilha 92% de identidade nucleotídica. No capítulo 4, através da caracterização molecular, reconstrução filogenética e análises de identidade por meio do Sequence Demarcation Tool (SDT) demonstrou-se que isolados virais depositados no GenBank identificados como tomato yellow spot virus (ToYSV) e Leonurus mosaic virus (LeMV) somados aos isolados de ToYSV recuperados por HTS no presente estudo se mostravam intimamente relacionados. Alguns compartilhavam os mesmos iterons e identidades iguais e/ou superiores a 91%, levando a concluir que foram erroneamente nomeados uma vez que se trata de uma única espécie viral. Esse vírus ocorre apenas esporadicamente no tomateiro, mas é o patógeno predominante em Leonurus. Neste contexto, foi elaborada uma proposição de que apenas a nomenclatura original/mais antiga (Leonurus mosaic virus) seja empregada para esse patógeno. O Capítulo 5 relata a detecção de um novo isolado de begomovírus infectando tomateiro na região norte do Brasil. O novo isolado de begomovírus foi detectado na amostra TO–083, originária de Araguaína, estado do Tocantins. O novo isolado é bipartido e clones infectivos foram produzidos e inoculados em tomateiros. A caracterização molecular do novo isolado identificou o iteron GGTGT/ACACC e o domínio da Rep relacionado ao iteron (Rep– IRD): MPRQPTTFRL. O isolado TO–083 foi então denomidado tomato golden leaf spot virus (ToGLSV). No capítulo 6, duas novas espécies de begomovírus monopartidos foram recuperadas por PCR com primers específicos. A nova espécie #1 foi detectada no nordeste brasileiro, nas amostras: CE–001, originária do estado do Ceará, PE–011 e PE–012, ambas de Pernambuco. A nova espécie #2 foi detectada nas amostras PR–173 e PR–174 ambas coletadas no estado do Paraná, sul do Brasil. As análises de recombinação demonstraram que as duas novas espécies são recombinantes envolvendo segmentos genômico de outros begomovírus previamente reportados infectando o tomateiro no Brasil. O begomovírus correspondente a nova espécie #1, nomeado tomato iridescent mottle virus (ToIMoV) está filogeneticamente mais próxima do tomato interveinal chlorosis virus (ToICV) (JF803252), enquanto que o tomato iridescent apical mosaic virus (ToIAMV), correspondente à nova espécie #2 está mais próxima do tomato mottle leaf curl virus (ToMoLCV) (MT215005). O capítulo 7 relata a detecção e caracterização molecular de um novo begomovírus bipartido (tomato bright apical mosaic virus –ToBAMV) infectando tomateiros, o qual foi detectado na região centro-oeste do Brasil. ToBAMV foi detectado em amostras de tomateiro oriundas do estado de Goiás (GO) e do Distrito Federal (DF), apresenta o segmento DNA–A de 2561 nucleotídeos (nts) e o DNA– B de 2527 nts. Este vírus está filogeneticamente mais relacionado com tomato golden vein virus (TGVV) (MN928612) com o qual compartilha 89% de identidade nucleotídica. As análises detectaram um evento de recombinação com tomato leaf curl purple vein virus (ToLCPVV) e tomato chlorotic mottle virus (ToCMoV). Estudos para a caracterização biológica dessa nova espécie bipartida serão realizados futuramente. O número crescente de espécies de begomovírus associadas com tomateiro que foram descritas aqui representam um grande desafio para o manejo e controle genético desse complexo de patógenos. O capítulo 8 compila os principais resultado desta tese, trazendo dados que fornece ao melhoramento genético do tomateiro, um panorama mais preciso sobre espécies de Geminiviridae que apresentam relevância epidemiológica no Brasil.
Abstract: The tomato (Solanum lycopersicum L.) crop is of great national and international importance. Several viruses can affect the tomato crop, causing considerable negative impacts. Among the tomato-infecting viruses, the species classified in the genus Begomovirus (family Geminiviridae) deserve to be emphasized (Chapter 1). Begomoviruses have a single-stranded circular DNA genomes that can be either monopartite or bipartite, being discriminated into two major groups: Old World and New World begomoviruses. Transmission of begomoviruses occurs through a complex of cryptic species of Bemisia tabaci (Aleyrodidae: Hemiptera) with a predominance of B. tabaci Middle East Asia Minor 1 – MEAM 1 (= biotype B) and B. tabaci Mediterranean – MED (= biotype Q). The range of host plants for begomoviruses is wide, including cultivated and uncultivated dicotyledonous. There is a great diversity of Begomovirus species already described and several new ones have been characterized in the last decade.The great diversity observed in begomoviruses is generated by three distinct mechanisms: mutation, recombination, and pseudorecombination. In Brazil, one of the promising strategies for controlling begomoviruses in tomato has been the use of cultivars with two resistance/tolerance factors (Ty–1 and Ty–3). With the increasing diversity of species, the use of tools such as HighThroughput Sequencing (HTS) has allowed extensive studies on this topic. Previous studies have indicated that cultivars carrying the Ty–1 gene reduce the number of begomovirus species able to infect tomatoes and impact their frequency and predominance, acting as a biological ‘filter’. Furthermore, new and/or recombinant species may overcome tolerance factors present in the host plant. Therefore, the objective of this work was to monitor and characterize via sequencing with HTS technology the viral diversity of the Geminiviridae family and subviral agents associated with begomoviruses associated with the tomato crop in five geographic regions of Brazil between the years 2003–2017. To achieve this objective, 154 samples from symptomatic tomato plants (with and without Ty–1 and Ty–3 factors) were collected in five Brazilian regions: North (13 samples), Northeast (36), South (24), Southeast (39) and Midwest (42). Samples were enriched with circular DNA using Rolling Circle Amplification (RCA). The enriched samples were grouped into two pools: BP1 (samples from the North, Northeast, and South regions) and BP2 (Southeast and Central-West) and submitted to HTS sequencing using the Illumina NovaSeq-6000 platform (Chapter 2). The sequences were assembled into contigs using the CLC genomics Workbench 7.5 software, analyzed in Geneious R11.1, compared with the sequence bank deposited in GenBank using the BLASTn algorithm. From the sequencing of the BP1 pool, 16 sequences corresponding to 16 viruses were recovered, 15 of which were classified in the genus Begomovirus, of which 11 corresponded to reports of already known species and four corresponded to potential new begomoviruses (new species #1; new species #2; new species #3 and new species #4), in addition to one Topilevirus species. Fourteen (14) sequences corresponding to 14 viruses and subviral agents were recovered from the sequencing of the BP2 pool, being a probable new species of begomovirus (new species #5) and also alphasatellite sequences associated with begomoviruses. Species-specific primers were used to recover the genomes by PCR in each sample individually. The Ty–1 and Ty–3 genes impacted viral diversity and the number of infected samples, with samples lacking these factors presenting a greater number of detected species and infections. The frequencies of mixed infections were also higher in tomato samples that did not have the Ty–1/Ty–3 factors. In Chapter 3, recovery by PCR assays with species-specific primers allowed the detection of the bipartite begomovirus tomato chlorotic mottle Guyane virus – ToCMoGV, previously absent in Brazil, in the sample called AM–035, collected in Iranduva, state of Amazonas, northern Brazil. Molecular analyzes and phylogenetic reconstructions demonstrated that ToCMoGV from Brazil consists of a strain with high divergence from the isolate of French Guiana, sharing 92% nucleotide identity in their DNA–A segment. In Chapter 4, it was demonstrated via molecular characterization, phylogenetic construction, and identity analysis (using the Sequence Demarcation Tool – SDT) that viral isolates identified as tomato yellow spot virus (ToYSV) and Leonurus mosaic virus (LeMV) in GenBank (as well as the ToYSV isolates recovered by HTS in the present study) were closely related. Some shared the same iterons and identities equal to and/or greater than 91%, leading to the conclusion that they were wrongly named since they are a single viral species. This virus occurs only sporadically in tomato, but is the predominant pathogen in Leonurus. In this context, a proposal was made that only the original/oldest nomenclature (i.e. Leonurus mosaic virus) should be used for this pathogen. The Chapter 5 reports the detection of a new begomovirus isolate infecting tomatoes in the Northern region of Brazil. The new begomovirus isolate was detected in sample TO–083, originating from Araguaína, state of Tocantins. The new isolate is bipartite and infective clones were produced and inoculated into tomato plants. Molecular characterization of the new isolate identified the GGTGT/ACACC iteron and the iteron-related Rep domain (Rep–IRD): MPRQPTTFRL. Isolate TO–083 was tentatively named as tomato golden leaf spot virus (ToGLSV). In Chapter 6, two new species of monopartite begomoviruses were recovered by PCRs with specific primers. The new species #1 was detected in northeastern Brazil, in samples: CE–001, originating from the state of Ceará, PE–011 and PE–012, both from Pernambuco. The new species #2 was detected in samples PR–173 and PR–174, both collected in the state of Paraná, southern Brazil. Recombination analyzes demonstrated that the two new species are recombinants involving genomic segments of other begomoviruses previously reported infecting tomato in Brazil. The begomovirus corresponding to new species #1, named tomato iridescent mottle virus (ToIMoV), is phylogenetically closer to tomato interveinal chlorosis virus (ToICV) (JF803252), while tomato iridescent apical mosaic virus (ToIAMV), corresponding to new species # 2 is closest to tomato mottle leaf curl virus (ToMoLCV) (MT215005). Chapter 7, reports the detection and molecular characterization of a new bipartite begomovirus (tomato bright apical mosaic virus –ToBAMV) infecting tomato plants, which was named in the central-western region of Brazil. ToBAMV was detected in tomato samples from the state of Goiás (GO) and the Federal District (DF), has the DNA–A segment of 2561 nucleotides (nts) and the DNA–B of 2527 nts. This virus is phylogenetically most closely related to tomato golden vein virus (TGVV) (MN928612) with which it shares 89% nucleotide identity. Further analyses detected a recombination event with tomato leaf curl purple vein virus (ToLCPVV) and tomato chlorotic mottle virus (ToCMoV). Studies dealing with the biological characterization of this new bipartite species are ongoing. The increasing number of Begomovirus species associated with tomato that have been described here represent a major challenge for the management and genetic control of this complex of pathogens. Chapter 8 compiles the main results of this thesis, bringing data that provide the genetic improvement of tomato, a more precise overview of Geminiviridae species that have epidemiological relevance in Brazil.
metadata.dc.description.unidade: Instituto de Ciências Biológicas (IB)
Departamento de Fitopatologia (IB FIT)
Description: Tese (doutorado) — Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Fitopatologia, 2024.
metadata.dc.description.ppg: Programa de Pós-Graduação em Fitopatologia
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Agência financiadora: Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).
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