Diversidade do complexo de Sida micrantha mosaic virus e caracterização de novos begomovírus em Malvaceae no Brasil

Abstract

Begomovirus (família Geminiviridae) corresponde ao maior gênero de vírus de plantas, englobando vírus que possuem uma ou duas moléculas de DNA circular de fita simples, encapsidados separadamente em partículas de 18-30 nanômetros. Isolados com genoma bipartido (apresentando os componentes DNA-A e DNA-B) predominam em tomateiro no Novo Mundo. Os begomovírus são transmitidos com grande eficiência pelo vetor Bemisia tabaci Middle East Asian Minor 1 – MEAM-1 (= biótipo B), que se encontra amplamente distribuído, apresentando hábito alimentar polífago e alta adaptabilidade a diferentes condições ambientais. A introdução de B. tabaci MEAM 1 no início da década de 1990 foi o fator desencadeador de epidemias de begomoviroses em tomateiro no Brasil, com subsequente aumento no número de relatos de novas espécies virais. Além disso, padrões distintos de diversidade e dinâmica de subpopulações virais foram observados em diferentes ambientes. Neste cenário, as plantas daninhas apresentam papel relevante por funcionarem como reservatórios naturais de begomovírus. Novas espécies virais têm sido relatadas em plantas daninhas, incluindo áreas dentro e no entorno de campos comerciais de tomateiro. Alguns begomovírus de plantas daninhas têm sido identificados e caracterizados biologicamente, entretanto acredita-se que estes estudos não tenham sido extensos o suficiente para estimar a real diversidade de novas espécies em plantas daninhas. No país, quatro begomovírus foram relatados infectando concomitantemente o tomateiro e plantas daninhas. A nível global, mais de 40 begomovírus foram descritos em espécies de Malvaceae, sendo que alguns destes foram detectados infectando originalmente espécies de Solanaceae. O genoma pequeno e bipartido somado a eficiência de transmissão e polifagia do vetor propiciam condições favoráveis para a ocorrência de infecções mistas e de eventos de recombinação e pseudo-recombinação entre begomovírus, contribuindo assim, para a frequente alteração da estrutura genética das populações virais nas nossas condições. Diferentes estratégias têm sido empregadas para analisar os processos evolutivos capazes de moldar a estrutura genético-molecular dos begomovírus. A principal delas tem sido a obtenção do genoma viral completo (DNA-A e DNA-B) para posterior análise através do uso de diferentes programas e modelos evolutivos. A metagenômica aliada ao High Throughput Sequencing tem permitido determinar uma grande diversidade viral presente no Brasil. Uma grande frequência de infecções mistas vem sendo detectada com muitas delas envolvendo potenciais espécies novas capazes de induzir sintomas severos em plantas. No presente trabalho, quatro contigs provenientes de HTS de amostras foliares de Malvaceae foram selecionados para estudo e caracterização, conforme metodologia realizada pela equipe do LVV-Fito e resumida a seguir. Inicialmente, amostras foliares de plantas daninhas exibindo sintomas típicos de begomovírus (clorose generalizada, mosaico e pontuações cloróticas) foram coletadas em áreas de produção de tomate e/ou áreas próximas ao cultivo de tomateiro, nas cinco regiões do país. As amostragens foram realizadas no período de 2001 a 2020, sendo analisado um total de 78 amostras foliares de plantas da família Malvaceae (selecionadas usando como critérios ano/local de coleta). O DNA total foi extraído via CTAB e solventes orgânicos e armazenado a - 20 °C. A confirmação inicial da presença de infecção por begomovírus nas amostras foi feita por meio de ensaios de PCR (reação em cadeia da polimerase) usando primers degenerados ‘PAR1c496’ e ‘PAL1v1978’. O DNA circular viral foi enriquecido nas amostras positivas via amplificação por círculo rolante (RCA). O sequenciamento de alto rendimento (HTS) foi realizado em uma plataforma Illumina NovaSeq 6000. Os contigs virais foram anotados e as leituras foram mapeadas de volta ao genoma anotado usando a ferramenta ‘Map to reference’ disponível no programa Geneious 11.1.5. Cerca de 7.391.728 milhões de leituras foram obtidas do pool de 78 amostras. Após a montagem, no programa CLC Genomics Workbench 11, foram obtidos 10.679 contigs. Quatro contigs foram selecionados. Três destes contigs correspondiam ao DNA-A completo e exibiram níveis de identidade inferiores a 91%, consistentes com o critério taxonômico atual de definição de novas espécies dentro do gênero Begomovirus. O componente DNA-A da potencial espécie nova #1 apresentou 79% de identidade com Sidastrum golden leaf spot virus (HM357458), a espécie nova #2 apresentou a identidade de 81% com Oxalis yellow vein virus (KM887907), enquanto a nova #3 apresentou a identidade de 78% com Sida yellow mosaic Alagoas virus (JX871383), confirmando a ocorrência de três novas espécies de begomovírus nas plantas daninhas. Os componentes DNA-B foram recuperados e as análises realizadas, incluindo a confirmação de cognatos. O quarto contig apresentou identidade de 98,24% com Sida micranta mosaic virus (SiMMV) (AJ557451). Após uso de primers específicos, já disponíveis, obteve-se um resultado de 41 amostras positivas para SiMMV A caracterização destas três espécies, bem como a ocorrência e distribuição de Sida micranta mosaic virus nas cinco regiões brasileiras, e a reavaliação da diversidade do complexo Sida micrantha mosaic virus (SiMMV) e Sida mottle virus (SiMoV) envolvendo o status da espécie, gama de hospedeiros e distribuição geográfica serão apresentados na presente dissertação.