DNA livre de célula no plasma seminal de touros Nelore : possível marcador para qualidade e congelabilidade do sêmen

Abstract

A criopreservação de sêmen é uma técnica amplamente utilizada na produção animal. Apesar de bem estabelecida em algumas espécies, a resposta à criopreservação e a capacidade do sêmen criopreservado de produzir embriões in vitro varia de indivíduo para indivíduo. Assim, buscando a identificação de um marcador que possa indicar a congelabilidade e fertilidade in vitro de uma amostra, antes do congelamento, este estudo avaliou a quantidade de DNA livre de células e o número de cópias de cfmtDNA no plasma seminal de touros Nelore. O sêmen de nove touros foi coletado por eletroejaculação, metade do ejaculado foi utilizado para avaliação do sêmen fresco e obtenção do plasma seminal para quantificação de cfDNA, a outra metade foi criopreservada. A avaliação de movimento espermático pelo CASA (IVOS 12.3/Hamilton-Thorne, EUA) e da integridade e estabilidade da membrana plasmática, integridade acrossomal, apoptose e potencial mitocondrial, por citometria de fluxo (AMNIS FlowSight - Amnis Corp., EUA) foram realizados no sêmen fresco e sêmen congelado às 0, 3, 6 e 12h após o descongelamento. O sêmen criopreservado também foi utilizado para a produção de embriões in vitro. A quantificação de cfDNA foi realizada no plasma seminal por espectrofotometria e o número relativo de cópias do cfmtDNA foi quantificado por qPCR. A concentração de cfDNA presente no plasma seminal variou de 15,23 ng/µL à 519,71 ng/µL. A mediana foi calculada (58,95 ng/µL) e dois grupos foram definidos de acordo com a concentração de cfDNA: Baixo-cfDNA (<58,95 ng/µL; n=5) e Alto-cfDNA (>58,95 ng/µL; n=4). O número de cópias de cfmtDNA foi semelhante (P>0,05) entre os grupos. No sêmen fresco, a porcentagem de células com estabilidade de membrana foi maior (P<0,05) no grupo Baixo-cfDNA (84,24%±7,07) comparado ao grupo AltocfDNA (52,72%±7,9) e, ao longo de 12 horas pós- descongelamento, não houve diferenças para todos os parâmetros avaliados entre os grupos. A taxa de clivagem e de blastocistos em D7 foi maior para o grupo Alto-cfDNA (60,74% ± 3,38 e 24,95% ± 2,56, respectivamente), do que para o grupo Baixo-cfDNA (41,21% ± 3,23 e 6,42% ± 1,14). O grupo Alto-cfDNA também produziu embriões com maior número de células. O número relativo de cópias de cfmtDNA variou entre 0,97 cópias a 24,38 cópias e, semelhante ao realizado com os dados de cfDNA, os touros foram divididos em dois grupos (Baixo-cfmtDNA e Alto-cfmtDNA), a partir da mediana (5,35 cópias). A porcentagem de espermatozoides em necrose foi maior (p<0,05) no grupo AltocfmtDNA do que o Baixo-cfmtDNA, tanto no sêmen fresco (40,6% ± 6,4 vs 17% ± 5,8 p=0,03), quanto no criopreservado (31,5±4,1 vs 19,7%±3,6 p=0,04). No sêmen fresco, VAP (109 μm/s ± 3,87) e VSL (91,5 μm/s ± 4,8) foram maiores no grupo BaixocfmtDNA). Para a porcentagem de espermatozoides em necrose foi detectada uma interação entre grupo e tempo (P<0,01), sendo que a porcentagem de espermatozoides em necrose que era superior no grupo Alto-cfmtDNA as 0 horas foi diminuindo ao longo do tempo, enquanto no grupo Baixo-cfmtDNA foi aumentado. Já a quantidade e qualidade de embriões produzidos foi semelhante para ambos os grupos. A concentração de cfDNA e o número relativo de cópias de cfmtDNA no plasma seminal não são capazes de predizer a congelabilidade do sêmen, mas animais com maior quantidade de cfDNA são capazes de produzir in vitro mais embriões e de melhor qualidade.