Production and characterisation of xylan degrading enzymes produced from Penicillium chrysogenum using agricultural biomass

Abstract

O fungo Penicillium chrysogenum, isolado de solo Cerrado, foi cultivado em meios de culturas contendo as biomass lignocelulósica bagaço de cana-de-açúcar (SCB)/palha (SCS), pele de laranja e avicel visando avaliar a produção de celobiohidrolase, endoglicanases, mananases, pectinase e xilanase. O tempo de produção de enzimas usando bagaço de cana foi avaliado por ensaio enzimático e eletroforese unidimensional por 10 dias consecutivos. A atividade máxima de endoglucanase (0.056 U.mL-1) e celobihidrolase (0.24 U.mL-1) foi maior no décimo dia de crescimento. Mananase e pectinase começaram a ser secretadas no segundo dia com um aumento gradual até o oitavo dia, atingindo a produção máxima de 0.11U.mL-1 e 0.10U.mL-1, respectivamente. A xilanase foi secretada no segundo dia de crescimento e a produção máxima (0.80U.mL-1) foi observada após o sexto dia. Os filtrados protéicos dos meios de cultura (CFPs) foram utilizados para hidrólise enzimática de bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado hidrotermicamente (ou submetido a pré-tratamento hidrotérmico), resultando na liberação de glicose (2.85g.L-1), xilose (2.15g.L-1) e celobiose (0.22g.L-1). O zimograma para xilanase mostrou a presença de três isoformas, das quais duas xilanases (PcX1 and PcX2) foram purificadas por cromatografia de troca iônica e gel filtração. A espectrometria de massas permitiu a identificação das enzimas, ambas endo-β-1, 4-xilanases. A enzima PcX1 (MW 35kDa) apresentou atividade máxima a 30°C e em pH 5.0, mostrando maior afinidade por xilana farinha de aveia, o valor de KM foi 1.2 mg.mL-1 enquanto o KM da xilana madeira de bétula foi 29.86 mg.mL-1. A análise da estrutura secundária da PcX1 por CD revelou as conformações α-helice, 45%, e folhas betas,10%, sendo consistente com a estrutura tridimensional predita. A PcX1 mostrou-se tolerante a vanilia, ácidos gálicos e tânico. A orientação de Trp mudou o ambiente para polar pela adição do ácido transferúlico, os valores de KM aumentaram e os valores de Vmax permaneceram inalterados, o que indica que o ácido ferúlico pode inibir a PcX1 por competição. A PcX2 possui massa de 23kDa, atividade ótima em pH 6.0 e 45oC (termostabilidade de 1h). Os valores cinéticos de KM e Vmax para PcX2 foram 0.53 mg.mL-1 para a xilana oat spelt. A estrutura terciária da PcX2 ficou estável na faixa de pH 4.0 a 9.0. PcX2 foi inibida por vanilia e pelo ácido 4-hidróxi-benzóico. As propriedades biofísicas mostraram que tFA e tCA não interferiram em sua conformação. PcX2 reteve 77% de atividade na presença de 0.6 mg.mL-1 ácido fenólico, a termoestabilidade bem como o aumento e a diminuição do KM justificaram a afinidade de PcX2 por seu substrato após a adição dos ácidos fenólicos. Ambas as xilanases foram sensíveis aos íos Cu+2 e Zn+2. Este trabalho trouxe uma melhor compreensão na cinética das xilanases (GH10 e GH11), suas propriedades físico-químicas, aplicações na indústria e interação com ácidos fenólicos.