Xanthomonas citri pv. viticola : detecção, diversidade de efetores e interação com hospedeiras alternativas

Abstract

O cancro bacteriano da videira, causado por Xanthomonas citri pv. viticola (Xcv), é a doença de maior preocupação entre os viticultores da região do Submédio do Vale do São Francisco, sendo responsável por quedas expressivas na produção, principalmente em variedades de uvas finas para mesa. Devido à sua ocorrência restrita e por representar risco ao desenvolvimento da viticultura nacional, o agente etiológico da doença é regulamentado como uma Praga Quarentenária Presente (PQP). Os objetivos principais deste estudo foram: (i) estabelecer protocolos de detecção molecular de Xcv em videiras assintomáticas via PCR em tempo real (qPCR), (ii) investigar aspectos da interação entre Xcv e hospedeiras alternativas e (iii) caracterizar o repertório de genes efetores do tipo III (T3Es) em Xcv. Para o desenvolvimento de protocolos de detecção molecular, foram desenhados e selecionados dois novos pares de primers, tendo como alvos sequências do gene de patogenicidade hrpB (Xcv18F/19R) e do cluster referente à síntese do pigmento xantomonadina (Xpig2F/1R). O par Xcv18F/19R apresentou especificidade limitada, mas foi eficiente para uso tanto em PCR convencional (cPCR) quanto em qPCR, enquanto o par Xpig2F/1R foi altamente específico para Xcv, mas mostrou baixa eficiência no formato qPCR. O limiar de detecção de Xcv em material vegetal foi determinado por extração de DNA total e enriquecimento das amostras em meio semisseletivo seguido de cPCR com os dois pares de primers selecionados e qPCR apenas com o par Xcv18F/19R. Para tanto, foram preparados extratos de folhas de videira com concentrações de inóculo variando de 107 a 1 UFC ml-1. Utilizando a etapa prévia de enriquecimento das amostras em meio de cultura observou-se um aumento de 10 vezes na sensibilidade, quando comparado com a extração de DNA total. A maior sensibilidade foi obtida no formato qPCR, detectando-se uma concentração inicial de 10 UFC ml-1. Em condições de infecção natural no campo, amostras de videiras sintomáticas e assintomáticas foram testadas por dois protocolos: qPCR com o par de primers Xcv18F/19R e cPCR com o par Xpig2F/1R. Nos dois casos empregou-se o enriquecimento prévio dos extratos em meio de cultura por 36-72h. Com ambos protocolos, detectou-se a presença de Xcv em todas as amostras sintomáticas. Nas amostras assintomáticas, a bactéria foi detectada em 93,4% por qPCR e em 89,5% por cPCR. Os protocolos desenvolvidos neste estudo apresentam vantagens quanto à especificidade e sensibilidade, sendo ferramentas valiosas para a detecção e identificação de Xcv em diferentes situações, tanto para fins de pesquisa quanto para rotinas de inspeção fitossanitária. Estudos de interação de Xcv com hospedeiras alternativas foram conduzidos para investigar a capacidade de colonização e translocação vascular do patógeno em Senna obtusifolia, e em espécies da família Amaranthaceae (Amaranthus cruentus, A. spinosus, Chenopodium giganteum e C. quinoa). Ensaios de dinâmica populacional demostraram que Xcv foi capaz de colonizar plantas de todas as cinco espécies avaliadas, além de sobreviver epifiticamente, por pelo menos 20 dias, em populações altas em folhas de S. obtusifolia. A capacidade de translocação vascular foi avaliada por inoculação do patógeno em caule e posterior detecção por BIO-PCR. Em plantas de S. obtusifolia, foi avaliada a translocação acropetal e basipetal, e em plantas da família Amaranthaceae, apenas a translocação acropetal. Resultados sugerem que Xcv é capaz de colonizar de forma sistêmica todas as espécies avaliadas. Para caracterizar o repertório de genes T3Es em Xcv, foram realizadas análises in silico nos três genomas disponíveis, pertencentes a dois isolados brasileiros (CCRMXCV 80 e CFBP 7764) e o patotipo indiano (LMG 965). Como resultado, foi identificado um repertório único de 27 genes. Porém, ao analisar as sequências de cada gene, foi observado uma deleção de um nucleotídeo no gene xopAD do patotipo indiano, resultando em uma proteína truncada. A distribuição de 29 genes T3Es de Xanthomonas spp., incluindo 20 dos genes detectados nos três genomas de Xcv, foi determinada por PCR em uma coleção de 68 isolados de Xcv. A diversidade de virulência dos isolados de Xcv em videira também foi avaliada com o objetivo de investigar possível correlação com a presença dos genes T3Es. Os resultados de PCR revelaram a presença de 22 genes T3Es em todos os isolados de Xcv, em contraste com uma alta diversidade de virulência em videira entre os isolados.