Análise bioquímica e estrutural de uma endoxilanase recombinante de Humicola grisea var. thermoidea em complexo com ácido ferúlico

Abstract

Uma endo-1,4-beta-xilanase de Humicola grisea var. thermoidea pertencente à família GH11 foi obtida por expressão em Pichia pastoris e denominada HXYN2. As endoxilanases são as principais hemicelulases comercializadas por serem aplicadas em vários setores industriais. Estudos que buscam compreender a relação estrutura e função destas enzimas são fundamentais para o aumento da eficiência catalítica em diferentes condições visando aplicação biotecnológica racional. A HXYN2 apresenta 227 resíduos de aminoácidos, massa molecular de 23 kDa e é termicamente estável, com maior atividade na faixa de 40-50 °C e pH 5,0-9,0, e temperatura e pH ótimos de 50 °C e 6,0, respectivamente. Nesta faixa de pH a HXYN2 apresenta estrutura estável com discretas mudanças conformacionais, indicadas pelos espectros de emissão de fluorescência com leve deslocamento das bandas de emissão, consistentes alterações nas cadeias laterais dos resíduos de triptofano e/ou de resíduos de aminoácidos que estão no microambiente do triptofano. Os espectros de dicroísmo circular (DC) da enzima em pH 4,0, 6,0, 7,0 e 9,0 apresentaram bandas típicas em comprimentos de onda que correspondem a proteínas com estruturas do tipo folhas beta. As curvas de desnaturação térmica obtidas em pH 6,0, 7,0 e 9,0 mostraram dois estados da proteína, nativa e desdobrada, com temperatura de transição (do inglês melting temperature - Tm) entre 50 e 60 °C. Em pH 4,0, esse ponto foi identificado entre 65 e 70 °C, o que sugere que HXYN2 é mais estável estruturalmente em pH ácido. O efeito de oito compostos fenólicos na atividade da HXYN2 foi avaliado e, dentre estes, o ácido ferúlico (AF) aumentou a atividade enzimática em 75%. Os parâmetros cinéticos indicaram que o AF não alterou a afinidade da enzima pelo substrato de xilana beechwood, mas aumentou a Vmax da reação, a eficiência catalítica e o número de turnover da enzima. Dados de calorimetria de titulação isotérmica (CTI), atenuação de fluorescência e docking molecular mostraram que o AF forma um complexo com a HXYN2 na região aglicona, interagindo com resíduos de triptofano expostos ao solvente e outros resíduos nesta vizinhança, por meio de ligações de hidrogênio, interações hidrofóbicas e iônicas. Os valores das constantes de ligação para o complexo HXYN2:AF são dependentes do pH e indicaram afinidade de moderada (em pH 7,0 e 9,0) a forte (em pH 4,0). Na presença de AF, os espectros de fluorescência de HXYN2 mostraram mudanças na posição e intensidade das bandas de emissão dependentes do pH. A estrutura secundária de HXYN2 na presença de AF foi alterada com diminuição da α-hélice e aumento de βturn e estruturas desordenadas. A curva de desnaturação térmica na presença do AF apresentou Tm de 54 °C, indicando menor estabilidade estrutural da HXYN2 na presença deste composto. Os cristais da HXYN2 foram obtidos em diferentes condições de cristalização na etapa de triagem. O refinamento destas condições resultou em cristais de diferentes formas e dimensões. Dois destes cristais foram levados ao Laboratório Nacional de Luz Síncroton – Sirius para coleta de dados de difração de raios X. Os dados de difração foram processados, e os resultados indicaram o grupo espacial P212121 (ortorrômbico), a presença de duas moléculas na unidade assimétrica e resolução de 1,6 Å. A estrutura cristalográfica da HXYN2 foi resolvida por substituição, utilizando como modelo as coordenadas atômicas da estrutura da endoxilanase de Thermomyces lanuginosus (PDB 1YNA), e o refinamento está em andamento.