Clonagem e avaliação da toxicidade de proteínas inseticidas de Bacillus thuringiensis para populações de Anticarsia gemmatalis (Lepidoptera: noctuidae) e Aedes aegypti (Diptera: culicidae)

Abstract

Nas últimas décadas, a agricultura mundial vem crescendo exponencialmente. Culturas como as da soja recebem destaque por influenciar na geração de divisas e empregos em todo mundo. Essa cultura está vulnerável a diversas pragas, dentre estas, destaca-se a lagarta da soja, Anticarsia gemmatalis Hübner, 1818 (Lepidoptera: Noctuidae), que é a principal desfolhadora da soja no Brasil. Além de provocar danos econômicos no setor agrícola, os insetos podem causar problemas relacionados à saúde pública. O principal exemplo é o Aedes aegypti, que é o vetor de doenças como a dengue e a febre amarela. Uma alternativa para o controle desses insetos é a utilização de agentes de controle biológico, como Bacillus thuringiensis (Bt). Essa bactéria possui a capacidade de produzir inclusões protéicas (proteínas Cry e Cyt) tóxicas para insetos e são largamente utilizadas no controle de pragas na agricultura e no controle de vetores de doenças humanas. Desta forma, o estudo do modo de ação e toxicidade dessas proteínas é importante para um melhor entendimento dos mecanismos de interação entre o patógeno e as pragas. Este trabalho teve como objetivo determinar a toxicidade de quatro proteínas Cry de B. thuringiensis para populações susceptíveis e resistentes de A. gemmatalis, e a construção de um baculovírus e de uma estirpe de Bt recombinantes contendo o gene cyt1Aa. Para o primeiro trabalho, as proteínas Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1Ac e Cry2Aa foram expressas individualmente por estirpes de Bt. As proteínas foram purificadas, solubilizadas, ativadas com tripsina e biotiniladas para a realização de bioensaios, ensaios de ligação e ensaios de competição heteróloga. O ensaio de ligação mostrou que ocorreu interação entre todas as proteínas e os receptores das duas populações de lagartas. O ensaio de competição heteróloga e os bioensaios demonstraram haver competição das proteínas pelos mesmos sítios de ligação para a população resistente de A. gemmatalis e que essa população tornou-se resistente, provavelmente, devido a alterações nos seus receptores. Além disso, os resultados obtidos nos bioensaios demonstraram que, apesar de todas as toxinas testadas apresentarem toxicidade para lagartas de segundo instar de A. gemmatalis, as proteínas Cry1Ab e Cry1Ac possuem toxicidade elevada quando comparadas com as outras proteínas testadas. No segundo trabalho, o gene cyt1Aa da estirpe S1806 de B. thuringiensis subsp. israelensis, foi amplificado por PCR, clonado em um vetor de clonagem e seqüenciado. A análise da seqüência do gene mostrou 100% de identidade com o gene cyt1Aa depositado no GenBank. O gene foi removido do vetor de clonagem, introduzido em um vetor de transferência (pFastBacTM1) e transferido para o genoma do baculovírus AcMNPV, utilizando o sistema Bac-to-Bac (Invitrogen), originando o baculovírus recombinante vFastCyt1Aa. Entretanto, a expressão da proteína recombinante não foi detectada em células de inseto infectadas com o vFastCyt1Aa. Além disso, o gene cyt1Aa foi inserido em um vetor de expressão para células de Bt (pSVP27A) e o plasmídeo recombinante (pSVPcyt1Aa) foi introduzido em uma estirpe de Bt acristalífera. Uma proteína de 27 kDa correspondente ao tamanho esperado para a proteína recombinante Cyt1Aa foi detectada por SDS-PAGE e Western-Blot de extratos de Bt recombinante. Entretanto, o extrato do Bt recombinante mostrou baixa toxicidade para mosquitos. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT

In the last decades, the world agriculture has grown exponentially. Crops like soybean have an important role in increasing foreign exchange and jobs all over the world. However, this crop is vulnerable to a diversity of insect pests that cause great economic losses. Among these insect pests, the soybean caterpillar, Anticarsia gemmatalis Hubner, 1918 (Lepidoptera: Noctuidae) is the main defoliator of soybean in Brazil. Besides the economic damage in agriculture, insects can also cause public health problems. Aedes aegypti, the vector of the dengue and yellow fever diseases is the main example. One alternative to control this insect is the use of biological control agents such as Bacillus thuringiensis (Bt). This bacterium produces protein inclusions (Cry and Cyt proteins) that are toxic to insects and are widelly used for the control of insect pests in agriculture and for the control of human disease vectors. Therefore, the study of the toxins mode of action and toxicity has a great importance for understanding the mechanisms of interaction between insect pests and their patogens. The aim of this study was the toxicity determination of four Cry proteins of B. thuringiensis to resistant and susceptible A. gemmatalis populations, and the construction of recombinant baculovirus and Bt containing the cyt1Aa gene. For the first work, the proteins Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1Ac e Cry2Aa were expressed individually by Bt strains. The proteins were purified, solubilized, activated with trypsin and biotinilated for bioassays, binding assays and heterologous competition assays. The binding assay showed binding affinities between all the proteins and the receptors in both populations of caterpillars. The heterologous competition assay and the bioassays showed competition between proteins for the same binding site in the resistant population of A. gemmatalis and this population became resistant probably because of modifications in their receptors. Besides that, the results of the bioassays demonstrate that Cry1Ab and Cry1Ac have higher toxicity to second instar larvae of A. gemmatalis when compared to the others toxins tested. In the second work, the cyt1Aa gene from the strain S1806 of B. thuringiensis subsp. israelensis was amplified by PCR, cloned in a vector and sequenced. The sequence analyses showed that the cloned gene from strain S1806 has 100% identity with a cyt1Aa gene deposited in GenBank. The gene was removed from the cloning vector, introduced into a transfer vector (pFastBacTM1) and transferred to the baculovirus genome AcMNPV, using the Bac-to-Bac system (Invitrogen), originating the recombinant baculovírus vFastCyt1Aa. However, no recombinant protein expression was detected in insect cells infected with vFastCyt1Aa. Furthermore, the cyt1Aa gene was also inserted in an expression vector for Bt cells (pSVP27A) and the recombinant plasmid (pSVPcyt1Aa) introduced into an acrystalliferous strain of Bt. A 27 kDa protein of the expected size for the recombinant Cyt1Aa was detected by SDS-PAGE and Western-Blot in recombinant Bt extracts. However, the recombinant Bt extracts showed low toxicity towards mosquitoes.