Expressão de genes candidatos para a aquisição da competência ovocitária em bovinos

Abstract

O sucesso das várias técnicas de reprodução assistida depende da competência do ovócito. Entretanto, os fatores envolvidos na sua aquisição e as características moleculares de um ovócito competente não são completamente conhecidos. Com o objetivo de avaliar genes relacionados com a competência do ovócito foi quantificado o nível de transcritos de genes candidatos em ovócitos (H1Foo, H2A, H3A, GHR, GDF9, BMP15, OOSP1) e nas células do cumulus (FSHR, EGFR, GHR, PTX3, IGF-II) com diferentes níveis de competência. Folículos ovarianos foram dissecados e distribuídos de acordo com seu diâmetro em quatro grupos: (1) 1,0 a 3,0 mm; (2) 3,1 a 6,0 mm; (3) 6,1 a 8,0 mm; (4) ≥ 8,1 mm. Os complexos cumulus-ovócitos (COCs) foram liberados, classificados morfologicamente, maturados, fecundados e cultivados in vitro, ou desnudados para a mensuração do diâmetro do ovócito. Os ovócitos em estágio de vesícula germinativa desnudados e suas células do cumulus correspondentes foram utilizados para análise de expressão gênica por RT-qPCR. A taxa de blastocistos foi maior nos ovócitos recuperados de folículos >6 mm, que nos outros dois grupos, confirmando que o tamanho folicular é um bom modelo para o estudo da competência. Nos ovócitos, somente os transcritos da H2A aumentaram gradualmente de acordo com o tamanho do folículo, sendo maior (P<0,05) nos ovócitos originados de folículos ≥8,1 mm do que naqueles menores que 6,0 mm. Dos cinco genes avaliados nas células do cumulus, três (FSHR, EGFR, GHR) mostraram diferença no nível de RNAm, aumentando deacordo com o tamanho folicular. Com base nos resultados, foi confirmada a implicação crítica da H2A no desenvolvimento da competência. Além disso, foram identificados genes importantes nas células do cumulus, os quais estão associados com a competência do ovócito e podem refletir a sua qualidade. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT

The success of the various assisted reproductive techniques depends on oocyte competence. However, the factors involved on its acquisition and the molecular attributes of competent oocyte are generally unknown. In an attempt to assess genes related with oocyte competence we quantify transcripts for candidate genes in oocytes (H1Foo, H2A, H3A, GHR, GDF9, BMP15, OOSP1) and cumulus cells (FSHR, EGFR, GHR, PTX3, IGF-II) of different levels of competence. Follicles were dissected and distributed according to their diameter into 4 groups: (1) 1.0 to 3.0 mm; (2) 3.1 to 6.0 mm; (3) 6.1 to 8.0 mm; (4) ≥ 8.1 mm. The COCs were released, morphologically classified, matured, fertilized and cultured in vitro or denuded for diameter measurements. The denuded germinal vesicle oocytes and their correspondent cumulus cells were used for gene expression analysis by RT-qPCR. Blastocyst rate was higher for the oocytes recovered from follicles >6 mm than the other two groups, confirming that follicles size is a good model to study competence. In the oocyte, only H2A transcript increased gradually according to follicle size, being greater (P<0.05) in oocyte originated from follicles ≥8.1 mm than those lower than 6.0 mm. Of the 5 genes evaluated in the cumulus cells, 3 (FSHR, EGFR and GHR) showed differences in mRNA level, increasing according to follicular size. In conclusion, we confirmed the critical implication of H2A on developmental competence, and identify important genes in cumulus cells which are associated with oocyte competence and can reflect its quality.