Síntese e determinação da estrutura de peptídeos antimicrobianos intragênicos de proteínas humanas

Abstract

O aumento da resistência aos antibióticos tem motivado a busca por novos fármacos com atividade antimicrobiana. Peptídeos são considerados uma alternativa promissora em virtude das vantagens inerentes a eles, como ação contra diversos microrganismos e a possibilidade de sinergismo com outros compostos. Estudos recentes mostram que determinadas sequências de aminoácidos encriptadas em proteínas, quando isoladas, podem apresentar atividades biológicas, como atividade antimicrobiana, que não manifestavam enquanto parte estrutural das proteínas precursoras. Assim, este trabalho tem como objetivo prospectar, caracterizar e determinar a estrutura tridimensional (3D) de peptídeos intragênicos com ação antimicrobiana e baixa citotoxicidade. Inicialmente, o peptídeo Hs02, oriundo de uma proteína humana, que teve sua atividade antimicrobiana comprovada em estudos anteriores, foi submetido à Ressonância Magnética Nuclear (RMN) para a determinação da sua estrutura 3D. Por meio dos experimentos 2D 1H1H TOCSY e 1H1H NOESY foi possível verificar que, na presença de micelas de DPC-d38, o peptídeo Hs02 adquire uma estrutura helicoidal anfipática bem definida entre os resíduos 3 e 14, com uma face polar composta por resíduos carregados positivamente. Foi observada ainda flexibilidade estrutural na porção N-terminal, especialmente na cadeia lateral do Triptofano 2, que pode estar interagindo com a membrana microbiana por meio de interações do tipo cátion-pi. Como proteínas humanas demonstraram ser uma boa fonte de fragmentos bioativos, cerca de 80 proteínas superexpressas no organismo humano durante infecções foram analisadas com o auxílio do programa Kamal - desenvolvido na Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia - com o intuito de encontrar sequências de aminoácidos com características físicoquímicas semelhantes as observadas em peptídeos antimicrobianos (PAMs). Foram selecionados 5 peptídeos, com possível estrutura em α-hélice (H05, H06, H07, H08 e H09) para síntese em fase sólida e purificação por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE). Esses peptídeos tiveram sua identidade confirmada por Espectrometria de Massa (EM) e foram submetidos a ensaios antimicrobianos. Entretanto, não apresentaram atividade antimicrobiana na faixa de concentração avaliada. Em seguida, a metodologia de prospecção foi adaptada para buscar peptídeos curtos similares a estruturas folha-β. O fragmento encontrado, denominado Hs10, demonstrou ser uma alternativa promissora, visto que apresenta atividade antimicrobiana, baixa citotoxicidade e é composto por apenas 9 resíduos de aminoácidos. Além disso, ensaios de Dicroísmo Circular (CD), Calorimetria de Titulação Isotérmica (ITC), Espalhamento de Luz (DLS) indicaram que o lipopolissacarídeo (LPS) presente na membrana externa de bactérias Gram-negativas está intimamente ligado ao mecanismo de ação do Hs10, e que a interação entre essas moléculas se dá principalmente por interações eletrostáticas. Estudos conformacionais por CD sugerem ainda que na presença de membranas biomiméticas aniônicas, as moléculas de Hs10 se organizam de maneira a formar uma estrutura anfipática similar a uma folha-β. Por fim, estudos realizados por meio da técnica de RMN indicam que o Hs10 tende a se estruturar na presença de uma pequena concentração de LPS, resultando em uma família de estruturas convergentes.