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2022_JônatasCunhaBarbosaLima.pdf | 9,94 MB | Adobe PDF | Voir/Ouvrir |
Titre: | Análises estruturais e de modelos de interação das proteases NS3 dos Flavivirus zika e dengue, e nsP2 dos alphavirus chikungunya e mayaro utilizando ferramentas in silico e in vitro |
Auteur(s): | Lima, Jônatas Cunha Barbosa |
Orientador(es):: | Barbosa, João Alexandre Ribeiro Gonçalves |
Assunto:: | Arbovírus Proteases Inibidores |
Date de publication: | 1-jui-2022 |
Data de defesa:: | 14-jan-2022 |
Référence bibliographique: | LIMA, Jônatas Cunha Barbosa. Análises estruturais e de modelos de interação das proteases NS3 dos Flavivirus zika e dengue, e nsP2 dos alphavirus chikungunya e mayaro utilizando ferramentas in silico e in vitro. 2022. 151 f., il. Tese (Doutorado em Biologia Molecular) — Universidade de Brasília, Brasília, 2022. |
Résumé: | Os arbovírus (Arthropod-borne virus) são uma classificação que compreende grupos virais cuja transmissão é realizada por vetores artrópodes que infectam vertebrados. Dentre esses, alguns arbovírus têm se mostrado de grande relevância, devido ao grande número de infecções, como os Flavivirus dengue (DENV) e o zika (ZIKV), e os Alphavirus chikungunya (CHIK) e o mayaro (MAYV), sendo que todos carecem de estudos estruturais mais aprofundados objetivando tanto um maior conhecimento da biologia molecular destes, quanto visando possíveis alvos para novos fármacos. Dentre as possíveis proteínas alvo, as proteases virais têm se mostrado excelentes alvos. Estas proteínas (NS3 nos Flavivirus e nsP2 nos Alphavirus) possuem a função de clivar determinadas regiões da poliproteína viral sendo essenciais para a replicação. O objetivo do presente trabalho é realizar análises in silico e in vitro das proteases dos arbovírus ZIKV, DENV, CHIK e MAYV visando uma melhor compreensão estrutural das proteases e da interação com inibidores e substratos. Os genes da NS3 de ZIKV e DENV, e nsP2 de MAYV e CHIK foram expressos em diversas cepas de E. coli e passaram por diversas etapas de otimização de purificação. Realizou-se ultracentrifugação analítica e cromatografia por exclusão molecular das proteases de ZIKV e DENV, que apontaram uma possível formação de dímero. Análises de espectroscopia de fluorescência da NS3 de ZIKV em presença de aprotinina demonstraram uma redução na intensidade de fluorescência possivelmente por maior exposição do Trp50 ao solvente, que poderia ser explicada pela dissociação dos dímeros. Screening e refinamento da cristalização de das proteases NS3 estudadas apresentaram condições onde havia formação de cristal de proteína, todavia não foram obtidos cristais que permitissem a resolução da estrutura. Foram realizados ensaios de inibição da NS3 de ZIKV com inibidores da protease homóloga DENV, os quais apresentaram capacidade inibitória também para esta proteína de ZIKV. Além disso, realizou-se a modelagem por homologia da protease do MAYV, docking com peptídeos que possuem os sítios de clivagem das nsP2 de CHIK e MAYV e dinâmica das principais poses. Neste experimento observou-se que as poses com melhores scores apresentavam semelhante posicionamento de uma glicina, altamente conservada na posição P2 de substratos de nsP2 de Alphavirus, em uma fissura estreita. Este posicionamento possivelmente auxilia no posicionamento do carbono da carbonila do substrato próximo ao enxofre da cisteína catalítica desprotonada facilitando o ataque nucleofílico, uma das primeiras etapas para a quebra da cadeia polipeptídica. Além disso, estabiliza os ângulos diedros χ1 e χ2 dos resíduos que compõe o sítio catalítico. |
Abstract: | The arbovirus (Arthropod-borne virus) are a classification that comprise viral groups whose transmission is performed by Arthropod vectors infecting vertebrate hosts. Among the arbovirus, dengue virus (DENV) and zika virus (ZIKV) of the family Flaviviridae and gender Flavivirus, and chikungunya virus (CHIK) and mayaro virus (MAYV) of the family Togaviridae and gender Alphavirus, have shown great relevance due to the large number of human infecting cases. All these viruses require deeper structural studies aiming at a much bigger knowledge of their molecular biology to develop new drugs able to counteract their diseases. Among the protein targets, the viral proteases have been recognized as excellent candidates. The proteins (NS3 of Flavivirus and nsP2 of Alphavirus) have a cleavage function in specific regions of the viral polyprotein, therefore they are essential to viral replication. The purpose of this work is to perform in silico and in vitro experiments of ZIKV, DENV, CHIK and MAYV proteases aiming at a better understanding of the structure and their interaction with inhibitors and substrates. The genes of ZIKV and DENV NS3 and, MAYV and CHIK nsP2 were expressed by several E. coli strains and followed by the optimization of their purifications. Analytical ultracentrifugation experiments and size exclusion chromatography were performed for the ZIKV and DENV protease, where a protein dimer was encountered. Fluorescence spectroscopy analysis of ZIKV protease in the presence of aprotinin demonstrated fluorescence intensity reduction possibly by the increase of Trp50 solvent accessibility, which could be explained by dimer dissociation. So far, crystal screening and refinement of the proteases yielded crystals with poor quality, preventing structure solution. Inhibition assays with DENV inhibitors for ZIKV NS3 protease were performed and demonstrated inhibitory capacity of the ZIKV protein. In addition, the MAYV protein homology modeling, docking of the CHIK and MAYV nsP2 cleavage site peptides and molecular dynamics of the best docking poses were performed. In docking experiments, it was observed that best scored poses had the substrate P2 glicine, a highly conserved residue in Alphavirus, placed in a narrow cleft at the protein surface. This arrangement possibly helps to position the substrate carbonyl carbon near the sulfur atom of the deprotonated catalytic cysteine, thus facilitating the nucleophilic attack, the first step of polypeptide chain cleavage. Moreover, this contact stabilizes dihedral angles χ1 and χ2 of the active site residues. |
Description: | Tese (doutorado) — Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2022. |
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Agência financiadora: | Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq); Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CNPq) e Fundação de Apoio à Pesquisa do Distrito Federal (FAP/DF). |
Collection(s) : | Teses, dissertações e produtos pós-doutorado |
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