Análises estruturais e de modelos de interação das proteases NS3 dos Flavivirus zika e dengue, e nsP2 dos Alphavirus chikungunya e mayaro utilizando ferramentas in silico e in vitro

Abstract

Os arbovírus (Arthropod-borne virus) são uma classificação que compreende grupos virais cuja transmissão é realizada por vetores artrópodes que infectam vertebrados. Dentre esses, alguns arbovírus têm se mostrado de grande relevância, devido ao grande número de infecções, como os Flavivirus dengue (DENV) e o zika (ZIKV), e os Alphavirus chikungunya (CHIK) e o mayaro (MAYV), sendo que todos carecem de estudos estruturais mais aprofundados objetivando tanto um maior conhecimento da biologia molecular destes, quanto visando possíveis alvos para novos fármacos. Dentre as possíveis proteínas alvo, as proteases virais têm se mostrado excelentes alvos. Estas proteínas (NS3 nos Flavivirus e nsP2 nos Alphavirus) possuem a função de clivar determinadas regiões da poliproteína viral sendo essenciais para a replicação. O objetivo do presente trabalho é realizar análises in silico e in vitro das proteases dos arbovírus ZIKV, DENV, CHIK e MAYV visando uma melhor compreensão estrutural das proteases e da interação com inibidores e substratos. Os genes da NS3 de ZIKV e DENV, e nsP2 de MAYV e CHIK foram expressos em diversas cepas de E. coli e passaram por diversas etapas de otimização de purificação. Realizou-se ultracentrifugação analítica e cromatografia por exclusão molecular das proteases de ZIKV e DENV, que apontaram uma possível formação de dímero. Análises de espectroscopia de fluorescência da NS3 de ZIKV em presença de aprotinina demonstraram uma redução na intensidade de fluorescência possivelmente por maior exposição do Trp50 ao solvente, que poderia ser explicada pela dissociação dos dímeros. Screening e refinamento da cristalização de das proteases NS3 estudadas apresentaram condições onde havia formação de cristal de proteína, todavia não foram obtidos cristais que permitissem a resolução da estrutura. Foram realizados ensaios de inibição da NS3 de ZIKV com inibidores da protease homóloga DENV, os quais apresentaram capacidade inibitória também para esta proteína de ZIKV. Além disso, realizou-se a modelagem por homologia da protease do MAYV, docking com peptídeos que possuem os sítios de clivagem das nsP2 de CHIK e MAYV e dinâmica das principais poses. Neste experimento observou-se que as poses com melhores scores apresentavam semelhante posicionamento de uma glicina, altamente conservada na posição P2 de substratos de nsP2 de Alphavirus, em uma fissura estreita. Este posicionamento possivelmente auxilia no posicionamento do carbono da carbonila do substrato próximo ao enxofre da cisteína catalítica desprotonada facilitando o ataque nucleofílico, uma das primeiras etapas para a quebra da cadeia polipeptídica. Além disso, estabiliza os ângulos diedros χ1 e χ2 dos resíduos que compõe o sítio catalítico.