Isolamento e caracterização molecular do vírus da cinomose canina, análise de antivirais e produção de uma proteína M recombinante

Abstract

O canine distemper virus (CDV), gênero Morbillivirus, tem emergido e sido reconhecido como um patógeno altamente contagioso e letal de cães domésticos (Canis familiaris). CDV também infecta e ameaça uma grande variedade de animais selvagens, incluindo, por exemplo, as famílias Canidea (cães selvagens, raposa, lobo, cão-guaxinim), Mustelidae (furão, gambá, visom, lontra) e Procyonidae (guaxinim, quati). Estudos sobre o CDV são necessários por conta das diversas lacunas envolvendo o assunto, entre as quais estudos de prevalência e caracterização molecular, terapias antivirais e produção de insumos laboratoriais para o diagnóstico. Dessa forma, o presente estudo foi realizado e está constituído em seis capítulos. No primeiro capítulo foi realizada a revisão bibliográfica envolvendo a temática em questão. O segundo capítulo se refere à combinação dos dados obtidos do inquérito molecular, incluindo também os dados da literatura sobre dectecção molecular e sorológica do vírus nas diversas regiões do mundo. Embora este capítulo tenha sido publicado na forma de meta-análise, destaca-se a inserção dos nossos dados experimentais no estudo, permitindo a geração de dados mais robustos quanto à frequência de positividade viral, juntamente com a análise de diversas variáveis potencialmente envolvidas com o fator infecção viral. Ainda em relação ao segundo capítulo, frisa-se que o mesmo envolveu a coleta de amostras biológicas de cães com suspeita clínica de cinomose, procedentes do município de Jataí-Goiás. Em suma, houve 34% (48/141) de positividade para o RNA viral nas amostras. Essas amostras também serviram de base para a realização dos capítulos três e quatro. O terceiro capítulo envolveu o isolamento e sequenciamento completo do CDV. Para tanto, pela primeira vez foram desenvolvidos dezenas de primers que permitiram flanquear todo o material genético. Assim, houve sucesso na amplificação e sequenciamento completo de uma amostra (JA88/20, 15,624 nt, GenBank: MW460905). Interessantemente, a linhagem isolada se separou num ramo e formou um subgenótipo dentro do genótipo América do Sul-I/Europa. No quarto capítulo, as amostras laboratorialmente positivas para o CDV, foram testadas quanto à amplificação dos genes estruturais M (1008 nt), F (1989 nt) e H (1824 nt). Mediante a utilização de novos primers, foi obtido sucesso na amplificação de quatro amostras (4/48). A partir da caracterização molecular destes genes estruturais, foi observada a circulação na região de uma única linhagem durante o período de estudo. Surpreendentemente, os sequenciados revelaram assinaturas moleculares únicas dos isolados no local. O quinto capítulo está relacionado à dinâmica molecular das proteínas M e N, juntamente com o fornecimento de conhecimentos a respeito da geração de drogas antivirais. Os resultados obtidos de dinâmica molecular mostraram que os modelos gerados são de alta qualidade. A partir destes modelos, foi verificado que os resíduos aminoacídicos considerados chave, das proteínas M e N, estão em local acessível, representando assim excelente sítio para a ancoragem de moléculas com potenciais antivirais. Finalmente, no sexto capítulo a proteína M foi expressa em Escherichia coli (BL21) e purificada. Também houve sucesso no emprego da proteína recombinante como substrato no ELISA. Os dados, mostraram que houve acurácia laboratorial na distinção entre amostras IgG anti-CDV positivas e negativas. Em síntese, a proteína recombinante produzida confirma nossa hipótese referente ao seu emprego em ensaios de imunodetecção.