Microrganismos geneticamente modificados aplicados à biocatálise

Abstract

Biocatálise refere-se à utilização de enzimas ou células inteiras de microrganismos como catalisadores em uma reação química representando uma rota sustentável para síntese de químicos, principalmente devido à possibilidade de se utilizar resíduos industriais como substrato, por exemplo, a biomassa lignocelulósica. Com os avanços no campo da biotecnologia, várias moléculas podem ser sintetizadas através de biocatálise, incluindo compostos não produzidos naturalmente por microrganismos. Nestes casos, ferramentas de engenharia genética são utilizadas para inserção de genes exógenos ou para deleção de vias endógenas que competem pelo substrato, otimizando o processo de produção. Além disso, novas técnicas para edição de genes estão constantemente sendo desenvolvidas, ampliando os limites da biocatálise. Neste trabalho, o conceito de biocatalisador foi aplicado em dois microrganismos para o desenvolvimento de rotas alternativas para síntese de ácido hialurônico (AH) e vanililamina (VA). AH é um biopolímero de alto valor, presente na composição de diversos produtos médicos e cosméticos. Abordagens alternativas para sua síntese estão sendo desenvolvidas para substituir o atual método utilizando processos fermentativos com espécies produtoras naturais de AH do gênero Streptococcus. Neste trabalho, AH foi produzido a partir linhagens geneticamente modificadas da levedura Ogataea (Hansenula) polymorpha. Para isso, o gene hasA (hasAp de Pasteurella multocida e hasAs de S. zooepidemicus), o qual codifica a enzima hyaluronan synthase (HAS), bem como o gene hasB (de Xenopus laevis), codificador da enzima UDP-glucose dehydrogenase, necessários para a síntese heteróloga de AH foram inseridos no genoma desta levedura. Além disso, foi implementado um interruptor genético para a regulação de hasA e hasB por uma serina integrase (integrase-13, Int13). Ao todo foram desenvolvidas três linhagens produtoras de AH, com a maior produção (≅ 200 mg/L) obtida pela linhagem EMB103 contendo o interruptor genético. Esse valor é inferior aos obtidos por outros produtores heterólogos de AH, incluindo leveduras. Contudo, o potencial de O. polymorpha para produção de AH através da expressão de diferentes genes hasA bem como a utilização de um interruptor genético nessa levedura foram demonstrados de forma inédita. A segunda parte deste trabalho foi relacionada à produção de VA a partir de substratos derivados da lignina (vanilina e ácido ferúlico) utilizando a bactéria Pseudomonas putida como biocatalisador, demonstrando uma nova rota biotecnológica para síntese de aminas aromáticas.

8 A produção de VA por uma linhagem geneticamente modificada de P. putida (GN442ΔPP_2426) foi realizada através da superexpressão do gene CV-ATA que codifica para uma amina transaminase (ATA) de Chromobacterium violaceum bem como três ATAs endógenas de P. putida KT2440 identificadas através de análises in silico. Além disso, os genes codificadores das três ATAs endógenas e o gene CV-ATA foram superexpressos em P. putida KT2440 resultando em linhagens capazes de utilizar VA, que não é prontamente metabolizada como única fonte de carbono por esta bactéria. A maior produção de VA (0.915 mM) a partir de vanilina (10 mM) foi obtida pela linhagem TMB-JH004 superexpressando CV-ATA. Contudo, o processo foi limitado principalmente pela reassimilação do produto VA e pela formação de dois coprodutos, o ácido vanílico e o álcool vanilil. A expressão do gene AlaDH, o qual codifica uma alanina desidrogenase de Bacillus subtilis, levou a uma redução da reassimilação de VA representando uma estratégia eficaz para melhorar a produção de VA a partir de vanilina. Portanto, esses resultados demonstram o potencial de P. putida como biocatalisador para produção de aminas aromáticas a partir de derivados da lignina.