Estrutura populacional e parâmetros epidemiológicos de isolados de Magnaporthe grisea (Barr)

Abstract

O arroz (Oryza sativa L.) é um dos principais cereais cultivados no Brasil, desempenhando um papel social e econômico de grande importância para as mais diversas regiões do país. Esse cereal é conduzido no Brasil sob dois principais sistemas de cultivo, o irrigado, tipicamente utilizado nos estados da região Sul do país e o de sequeiro, tradicional na abertura de novas áreas e nas regiões Centro, Norte e Nordeste do Brasil. Para cada sistema de cultivo são utilizados grupos de cultivares adaptadas a condições específicas, principalmente quanto ao fornecimento de água. (sem parágrafo) A brusone, causada pelo fungo Pyricularia grisea (Cooke) Sacc. cuja fase teleomórfica corresponde a Magnaporthe grisea (Barr), é um dos principais fatores limitantes para a cultura do arroz no Brasil e no mundo. O controle é feito, principalmente, pelo uso de cultivares resistentes e fungidas. No entanto, o controle químico através de fungicidas específicos, além de elevar o custo de produção do cereal, causa vários danos ao meio ambiente, e deve ser utilizado integrado a outras técnicas de manejo. Programas de melhoramento genético de arroz são conduzidos no país por diferentes instituições, gerando, a cada ano, novas cultivares de arroz com resistência vertical a brusone. A estreita base genética dos programas de melhoramento tem contribuído para a quebra de resistência das novas cultivares lançadas por estes programas em apenas 1 ou 2 anos após o lançamento, especialmente no Estado do Tocantins. Quebras de resistência em período tão curto apontam para a necessidade busca de fontes de resistência duráveis à brusone, especialmente nas regiões tropicais de cultivo de arroz, onde a variabilidade genética do patógeno é alta. Para tanto, é de suma importância o conhecimento sobre as populações do patógeno e de suas interações com as plantas hospedeiras. O conhecimento mais aprofundado das características das populações de Magnaporthe grisea da região Centro-Norte do Brasil é condição fundamental na orientação dos programas de melhoramento do hospedeiro. O patossistema arroz/brusone é estudado há muito tempo em várias partes do mundo. Porém, no Brasil ainda foi pouco explorado, havendo necessidade de pesquisas em regiões com alto potencial produtivo, como os Estados do Pará, Rondônia, Acre, Tocantins e Maranhão, especialmente em virtude da expansão da fronteira agrícola do arroz de sequeiro. Objetivou-se, a partir do presente trabalho, identificar a estabilidade da cultivar Oryzica Llanos 5 (modelo de cultivar com resistência durável, oriunda da Colômbia) quando inoculada com isolados de M. grisea coletados na região Centro-Norte do Brasil, mediante avaliações de parâmetros epidemiológicos como período de incubação, latência, severidade e agressividade da doença. Além disso, objetivou-se detectar, a partir de estudos moleculares, a variabilidade genética e a estrutura populacional de isolados coletados no Tocantins, Goiás e Pará. No capítulo 1 desta dissertação descreve-se a ocorrência de isolados de M. grisea, coletados nos estados do Centro-Norte do Brasil, capazes de quebrar a resistência genética na cultivar Oryzica Llanos 5, padrão de resistência à doença, e examinam-se possíveis interações entre a virulência a esta cultivar e alguns parâmetros monocíclicos das epidemias de brusone. Para tanto, foram avaliados 35 isolados monospóricos de M. grisea obtidos nos municípios de Lagoa da Confusão, Dueré, Formoso do Araguaia (Tocantins), Luiz Alves do Araguaia (Goiás) e Paragominas (Pará). Objetivando-se a quantificação do desenvolvimento micelial dos isolados in vitro, calculou-se, a cada 3 dias, a área da colônia, a partir da qual obteve-se a área sob a curva de crescimento micelial (ASCCM) para cada um dos isolados. Os parâmetros epidemiológicos (período de incubação, período de latência, severidade da doença e área sob a curva de progresso da doença ASCPD), foram determinados em casa de vegetação, para todos os 35 isolados em três variedades de arroz (Caloro e Fanny suscetíveis; Oryzica Llanos 5 resistente). As plantas foram avaliadas a cada três dias através de análise visual baseada em uma escala de notas de sete classes (0, 1, 3, 4, 5, 7 e 9). No estudo in vitro, houve diferença significativa (p0,05) da ASCCM entre os isolados, independente do local de coleta. Nos experimentos de casa de vegetação, o período de incubação nas cultivares suscetíveis variou entre 1,00 dia (isolado F-2) e 5,75 dias (isolado LA-2) em Caloro; e entre 1,00 dia (isolado F- 2) e 6,25 dias (isolado LA-2) em Fanny. Quando os isolados monospóricos foram inoculados na cultivar resistente Oryzica Llanos 5, observou-se que 34% dos isolados estudados apresentaram quebra de resistência (F-1, F-2, F-5, F-9, F-10, LC-1, LC-2, LC-4, D-2, P-2 e P- 6). Os isolados que quebraram resistência apresentaram os menores períodos de incubação (ex. isolado D-1, 2,0 dias), enquanto que os isolados que não quebraram resistência apresentaram os maiores períodos de incubação (ex. isolado LA-2, 6,25 dias). Isolados que quebraram resistência apresentaram também o menor período de latência. Observou-se forte correlação positiva entre a severidade da doença aos 6, 9 e 12 DAI e a ASCPD, e uma significativa correlação negativa entre período de incubação ou de latência e a ASCPD. As ASCPDs nas cultivares suscetíveis foram maiores que no padrão de resistência. É importante ressaltar a quebra de resistência genética da cultivar Oryzica Llanos 5, até o momento considerada como padrão de resistência, por isolados de M. grisea coletados no Centro-Norte do Brasil. O resultado desses estudos demonstra claramente a alta diversidade genética do patógeno nesta região. No capítulo 2, objetivou-se identificar a diversidade genética e a estrutura de população de isolados monospóricos coletados em lavouras comerciais de arroz nos Estados de Tocantins, Goiás e Pará. Para tanto, conduziram-se ensaios na Embrapa-CENARGEN, onde foram avaliados 140 isolados monospóricos de M. grisea obtidos nos municípios de Lagoa da Confusão, Dueré e Formoso do Araguaia (Tocantins), Luiz Alves do Araguaia (Goiás) e Paragominas (Pará). Neste estudo, 34 marcadores microssatélites marcados com fluorocromo foram utilizados para a genotipagem automática em sequenciador de DNA. Quatorze marcadores microssatélites mostraram-se altamente eficientes para estimar a diversidade genética e detectar estruturação em população de isolados monospóricos de M. grisea. Alguns deles apresentaram um conteúdo informativo elevado, facilitando a genotipagem em escala e propiciando alta eficiência na análise de polimorfismo de DNA. A média do número de alelos por loco foi 6,35, variando de 2 alelos para os marcadores ms 109 - 110, ms 115 - 116, ms 61 - 62 a 16 alelos para o marcador PG 27. Os índices de diversidade genética (DG), conteúdo polimórfico informativo (PIC) e probabilidade de identidade (PI), confirmaram a eficiência destes marcadores. A população de isolados de M. grisea do Centro Norte do Brasil apresentou substruturação em três sub-populações (K=3). Os isolados de Goiás (Luiz Alves) em sua maioria foram observados no Grupo 1, os isolados de Tocantins (Formoso, Dueré e Lagoa da Confusão) em sua maioria foram observados no Grupo 2 e os isolados do Pará (Paragominas) foram observados no Grupo 3. Os isolados do Pará são os mais distantes geneticamente em relação aos isolados de Goiás e Tocantins. A alta diversidade genética observada na metapopulação de M. grisea do Centro-Norte brasileiro, assim como a evidência de estruturação, sugerem a necessidade de monitoramento específico e emprego de estratégias adequadas pelos programas de melhoramento genético para as sub-populações detectadas. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT

Rice (Oryza sativa L.) is one of the main cereals cultivated in Brazil, carrying an important social and economical role in several geographical regions. Rice is cultivated in Brazil in two main cropping systems, irrigated, typical of the Southern region and dry land (sequeiro), tradicionally used for opening new areas in the Center, Northern and Northeastern parts of Brazil. For each cultivation system, a group of cultivars, especially adapted to each condition, are used. Rice blast, caused by the fungus Pyricularia grisea (Cooke) Sacc. teleomorph Magnaporthe grisea (Barr), is one of the main limiting factors to rice production in Brazil and elsewhere. Control is mainly by a combination of resistant cultivars and fungicides. However, the use of fungicides increases production costs and may be damaging to the environment, and should be used integrated with other disease management techniques. Several rice breeding programs are conducted in Brazil by a number of different research institutions, every year offering new rice cultivars with vertical resistance to blast to growers. Unfortunately, the narrow genetic basis of the breeding programs has contributed to resistance breakdown of these new rice cultivars just 1 or 2 years after release, as has been observed in the State of Tocantins. Resistance breakdown in such a short period of time points towards the need to find and select durable sources of resistance, especially in the tropical regions, where genetic variability of the pathogen is seemingly very high. However, before beginning the search of sources of host resistance, knowledge of the pathogen population variability is very important, as well as of its interactions with its plant host. Deeper knowledge of the populations of Magnaporthe grisea from Central-North Brazil is a fundamental condition for the orientation of rice breeding programs. The rice blast pathosystem has been studied for some time in other geographic regions, but is still hardly explored in Brazil. Therefore, there is a pressing need to conduct prospective diversity research of the pathogen in regions with high yielding potential, such as the States of Pará, Rondônia, Acre, Tocantins and Maranhão, especially taking into account the expansion of dry land rice. This study aimed to describe the stability of rice cultivar Oryzica Llanos 5 (standard of durable resistance, originated in Colômbia) when inoculated with M. grisea isolates of collected in the Center-Northern Brazil, by estimations of epidemiological parameters, such as period of incubation, latent period, severity and pathogen aggressiveness. In addition, the genetic variability and the populational structure of M. grisea isolates collected in the States of Tocantins, Goiás and Pará were examined by molecular studies. Chapter 1 describes the discovery of isolates of M. grisea from the States of Tocantins (TO), Goiás (GO) and Pará (PA), capable of breaking the resistance of cv. Oryzica Llanos 5, the standard of genetic resistance to rice blast, and examines possible interactions between virulence and some monocyclic components of rice blast epidemics. Towards that end, thirtyfive monosporic isolates of M. grisea from the counties of Lagoa da Confusão, Dueré, Formoso do Araguaia (TO), Luiz Alves do Araguaia (GO) and Paragominas (PA) were studied. Radial mycelial growth was determined in vitro, every third day, and the area under the curve of mycelial growth (AUCMG) of each isolate was compared. Epidemiological parameters (period of incubation, latent period, disease severity and the area under disease progress curve AUDPC) were estimated in the greenhouse, for each of the thirty-four isolates in three rice cultivars (Caloro and Fanny susceptible; Oryzica Llanos 5 resistant). Plants were evaluated visually every third day, with the aid of a diagrammatic scale of seven classes (0, 1, 3, 4, 5, 7 and 9). In the in vitro study, the AUCMG was significantly different among isolates (p0,05), irrespective of geographical origin. Period of incubation in susceptible cultivars varied from 1.00 day (isolate F-2) to 5.75 days (isolate LA-2) on Caloro; and between 1.00 day (isolate F-2) to 6.25 days (isolate LA-2) on Fanny. When the monosporic isolates were inoculated on resistant cv. Oryzica Llanos 5, 34% broke its resistance (F-1, F-2, F-5, F-9, F-10, LC-1, LC-2, LC-4, D-2, P-2 e P-6). The isolates that broke Oryzica Llanos 5 resistance also had the shortest incubation periods (e.g. isolate D-1, 2.0 days), while the isolates that did not show resistance breakdown, generally had the longest incubation periods (e.g. isolate LA-2, 6.25 days). Isolates virulent on Oryzica Llanos also had the shortest latent periods. A significant and positive correlation was observed between disease severity at 6, 9 and 12 days after inoculation and the AUDPC, and a significant and negative correlation was generally observed between period of incubation or latent period and the AUDPC. The AUDPCs of susceptible cultivars were larger than in the resistant cultivar. The resistance breakdown of cv. Oryzica Llanos 5, so far the resistant standard, by isolates of M. grisea from the Brazilian Central-North region is reported here for the first time and is a clear indication of the high genetic diversity of the pathogen in this region, which therefore poses a great threat to rice production in Brazil. In chapter 2, monosporic isolates collected at commercial rice farming at the states of Tocantins, Goiás and Pará were examined for genetic diversity and population structure. In order to examine the diversity, essays were conducted at Embrapa-CENARGEN, where 140 M. grisea monosporic isolates obtained from the counties of Lagoa da Confusão, Dueré and Formoso do Araguaia (Tocantins), Luiz Alves do Araguaia (Goiás) and Paragominas (Pará) were evaluated. For this study, 34 microsatelite markers marked with fluorochrome were used for automatic genotyping in DNA sequencing. Fourteen microsatelites markers appeared highly efficient to estimate genetic diversity and to detect structuration in the M. grisea metapopulation from Central-North Brazil. Some of them had high informative content, facilitating genotyping in scale and DNA polymorphism analysis. The medium number of alleles per loco was 6.35, varying from 2 alleles by markers ms 109 110, ms 115 - 116, ms 61 62 to 16 alleles by marker PG 27. Genetic diversity index (GD), informative polymorphic content (IPC) and identity portability (IP), confirmed these markers efficiency. M. grisea metapopulation from Central-North Brazil was substructured in three sub-populations (K=3). Goiás (Luiz Alves) isolates were mostly observed in Group 1, Tocantins (Formoso, Dueré and Lagoa da Confusão) isolates were mainly observed in Group 2 and Pará (Paragominas) isolates were all observed in Group 3. Group 3 isolates (Pará) were the most genetically distant in relation to isolates of Goiás and Tocantins. The high genetic diversity observed in the M. grisea metapopulation, as well as the evidence of populational sub-structures, suggest the need of specific monitoring and the use of adequate strategies by genetic improvement programs to each of the sub-populations identified.