Análise da variabilidade genética, filogenia e expressão gênica de HPV de alto risco no Distrito Federal

Abstract

Mais de 100 tipos de HPV foram descritos, dos quais 13 são classificados como de alto risco devido à sua associação com o desenvolvimento do câncer cervical. O presente estudo investigou a variabilidade e filogenia dos HPV de alto risco -31, -33, - 35, -52 e -58, isolados a partir de amostras do Distrito Federal. Para tanto, a LCR e os genes E6 e L1 foram sequenciados. Diversos variantes foram detectados, incluindo 13 novos variantes de todos os tipos analisados. A análise filogenética dos isolados de HPV-31, -33, -35 e -58 não revelaram agrupamentos étnicos ou geográficos como observados previamente para os HPV-16 e -18. A análise do HPV-35 mostrou uma topologia dicotômica característica de subtipos do HPV. Interessantemente, quatro agrupamentos foram identificados na análise de variantes de HPV-52, dos quais dois puderam ser classificados como ramos Asiático e Europeu. Além disso, nós comparamos a atividade do promotor de E6/E7 de variantes moleculares do HPV-58 detectados no Distrito Federal, uma vez que este é o segundo tipo mais frequentemente detectado em lesões cervicais de alto grau nessa região. Para este propósito, as sequências da LCR do protótipo do HPV-58 e de três variantes foram amplificadas e clonadas à montante do gene repórter luciferase e transfectados transientemente em células C33. Para comparação, também foram analisadas as sequências da LCR dos HPV-18 e -16. O protótipo do HPV-58 e os variantes Bsb-329 e Bsb-327 mostraram atividade transcricional similar ao HPV-16, mas cerca de seis vezes menor que o HPV- 18. Interessantemente, o variante de HPV-58 Bsb-295 apresentou uma alta atividade transcricional, mesmo comparável ao HPV-18. Esse variante de HPV-58 é o único isolado em que foi detectada a substituição nucleotídica na posição 7788. Foram construídos mutantes por meio de mutagênese sítio-dirigida com o intuito de analisar o impacto dessa alteração nucleotídica na atividade do promotor viral. A introdução da mutação 7788 no isolado protótipo do HPV-58 levou a uma atividade transcricional similar ao observado para o variante Bsb-295 e o protótipo do HPV-18. Em conjunto, os dados indicam que essa única variação é capaz de aumentar a atividade do promotor viral e poderia levar a uma maior expressão dos oncogenes virais E6 e E7 in vivo. Entretanto, estudos adicionais são necessários para identificar os fatores transcricionais celulares envolvidos nessa regulação. O estudo dos variantes de HPV é crucial para entender a sua distribuição geográfica e as diferenças biológicas desses vírus, contribuindo ainda para estudos sobre sua infectividade e patogenicidade. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT

More than 100 HPV types have been described, of which 13 are classified as high-risk due to their association with the development of cervical cancer. The present study explores nucleotide variability and phylogeny of high-risk HPV-31, -33, -35, -52 and -58, isolated from samples from Distrito Federal. For this purpose, the LCR and E6 and L1 genes were sequenced. Several variants of these HPV types were detected, including 13 new variants among all types analyzed. The phylogenetic analysis of HPV- 31, -33, -35 and -58 isolates did not reveal any ethnic or geographical clustering, as observed previously for HPV-16 and -18. HPV-35 analysis showed a dichotomic branching characteristic of HPV subtypes. Interestingly, four clusters relative to the analysis of HPV-52 variants were identified, of which two could be classified as Asian and European branches. In addition, we compared E6/E7 promoter activity of HPV-58 molecular variants detected in Distrito Federal, since this is the second most frequent type detected among high-grade cervical lesions in this geographical area. For this porpouse, complete LCR sequences from HPV-58 prototype and three more variants were amplified, cloned upstream of the luciferase reporter gene and transiently transfected in C33 cells. For comparison, plasmids containing HPV-18 or -16 prototype LCR sequences were also analyzed. HPV-58 prototype and HPV-58 variants Bsb-329 and Bsb-327 showed promoter activity similar to HPV-16 but about six times lower than HPV-18. Interestingly, HPV-58 variant Bsb-295 presented a high promoter activity, even comparable to HPV-18. This HPV-58 variant is the only isolate in which we detected a substitution in nucleotide position 7788. Mutants were constructed by site-direct mutagenesis in order to analyze the impact of this nucleotide alteration on viral promoter activity. The introduction of the 7788 mutation in the HPV-58 prototype isolate led to a transcription activity similar to that observed for HPV-58 variant Bsb- 295 and HPV-18 prototype. Taken together, these data indicate that this single nucleotide variation is capable of enhancing viral promoter activity and could lead to a higher expression of E6 and E7 viral oncogenes in vivo. Nevertheless, additional studies are necessary to further identify cellular transcriptional factors involved in this regulation. The study of HPV variants is crucial to understand the intrinsic geographical relatedness and biological differences of these viruses and further contributes to studies concerning their infectivity and pathogenicity.