As enzimas presentes no trato digestivo dos insetos : um alvo susceptível de inibição

Abstract

Sementes do feijão (Phaseolus coccineus) foram analisadas pela presença e atividade do inibidor de amilase (-AI). Por meio do uso de anticorpos policlonais gerados contra o inibidor -AI-1 do feijão comum (P. vulgaris), foi possível detectar polipeptídios típicos deste inibidor (Mr. 14 18 kDa), além do polipeptídeo de 32 kDa. Os resultados encontrados nos testes de inibição permitem sugerir que o inibidor presente nas sementes de P. coccineus 35590 seria o melhor candidato para a transformação genética do café visando à geração de plantas com resistência a larvas da broca-do-café. A digestão proteolítica in vitro do inibidor puro causou uma perda rápida da sua atividade inibitória, afetando seriamente sua capacidade natural de interagir com as -amilases. Também, neste trabalho foram estudadas as propriedades das -amilases presentes no trato digestivo de larvas de Tecia solanivora, um inseto-praga que gera um dano importante à batata (Solanum tuberosum). O inseto tem no mínimo três isoformas principais de -amilases digestivas, as quais apresentaram pontos isoelétricos de 5.30, 5.70 e 5.98. A atividade da -amilase digestiva tem um pH ótimo entre 7.0 e 10.0, com um pico de atividade em pH 9.0. A enzima foi inibida por inibidores de natureza protéica presentes nas sementes de P. coccineus (70% de inibição) e de P. vulgaris cv Radical (87% de inibição) em pH 6.0. Os resultados mostram também que o inibidor de - amilase de amaranto pode ser o melhor candidato para gerar batatas modificadas geneticamente resistentes a este inseto-praga. Futuras pesquisas precisam ser desenvolvidas para esclarecer se estes inibidores de -amilase são resistentes às proteases presentes no trato digestivo da lagarta de batata, T. solanivora. Em um ensaio subseqüente, foi desenvolvido e testado um novo e sensível método espectrofotométrico para a detecção da atividada leucine aminopeptidase (-aminoacyl-peptide hydrolase, EC 3.4.11.1) proveniente do trato digestivo de larvas de Telchin licus (Lepidoptera: Castniidae), fazendo uso do substrato L-leucyl-2- naphthylamide. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT

Seeds of scarlet runner bean (Phaseolus coccineus L.) were analyzed for -amylase inhibitor (-AI) activity. By using polyclonal antibodies raised against pure a−AI-1 from common bean (Phaseolus vulgaris L.) it was possible to detect the typical -AI polypeptides (Mr 14 -18 kDa) as well as a large polypeptide of Mr 32,000 Da. Differential inhibition curves lead us to suggest that the gene encoding one of the inhibitors in P. coccineus (in accession G35590) would be a good candidate for genetic engineering of coffee resistance towards the coffee berry borer Hypothenemus hampei Ferrari (Coleoptera: Scolytidae). An in vitro proteolytic digestion treatment of pure a−AI−1, resulted in a rapid loss of the inhibitory activity, seriously affecting its natural capacity to interact with mammalian -amylases. In addition, the properties of the digestive -amylase from T. solanivora larvae, an important insect pest of potato (Solanum tuberosum), were studied. This insect has three major digestive -amylases with isoelectric points 5.30; 5.70 and 5.98 respectively, which were separated using native and isoelectric focusing gels. The -amylase activity has an optimum pH between 7.0 and 10.0 with a peak at pH 9.0. The enzyme was inhibited by proteinaceous inhibitors from P. coccineus (70% inhibition) and P. vulgaris cv. Radical (87% inhibition) at pH 6.0. The results show that the -amylase inhibitor from Amaranthus may be a better candidate to make genetically modified potatoes resistant to this insect. However, it is necessary to know if these -amylase inhibitors are resistant to the gut proteases from T. solanivora. On the other hand, a simple and sensitive spectrophotometric assay to determine the activity of leucine aminopeptidase (-aminoacyl-peptide hydrolase, EC 3.4.11.1) from insect intestinal tracts of Telchin licus (Lepidoptera: Castniidae), using L-leucyl-2- naphthylamide as substrate, was developed.