Estudos biológicos e moleculares de um isolado necrótico de bean yellow mosaic virus (BYMV), não transmitido por afídeos

Abstract

Bean yellow mosaic virus (BYMV) é uma espécie do gênero Potyvirus, da família Potyviridae. Esses vírus são transmitidos por afídeos de maneira não persistente, exigindo para tal a presença de duas proteínas codificadas pelo vírus: a proteína da capa (CP) e a proteinase “helper component” (HC-Pro). Mutações em alguns poucos blocos de aminoácidos nestas duas proteínas estão relacionadas com a perda da transmissão de potyvirus por afídeos. Mutações no “triplet” altamente conservado D/NAG, localizado na região N-terminal da CP, e nos blocos KITC e PTK, localizados respectivamente no N-terminal e no C-terminal de HC-Pro, foram associadas com esta perda. Uma estirpe necrótica de BYMV, denominada BYMVn, não foi transmitida por 15 diferentes espécies de afídeos. Ensaios de transmissão dependente, utilizando-se BCMV como vírus auxiliar, e com dez diferentes fontes de inóculo também foram negativos. Visando elucidar a base molecular da não transmissão de BYMVn, a porção Nterminal da CP foi caracterizada. RNA total de planta infectada com BYMVn foi extraído e utilizado como molde na obtenção de cDNA. Este último foi submetido à amplificação por PCR e o produto obtido (414pb da região N-terminal da CP) foi ligado ao plasmídio pGemT Vector. O clone obtido foi sequenciado, permitindo a leitura de 170 nucleotídeos da região 5’ e 208 da região 3’ do fragmento. O “triplet” NAG da CP mostrou-se conservado, não podendo ser associado a não transmissão de BYMVn por afídeos. Análise molecular subsequente de HC-Pro poderia mostrar se mutações nos blocos KITC e/ou PTK estariam, portanto, envolvidas na perda da capacidade de transmissão de BYMVn pelo inseto vetor. Como aproximadamente 40% da CP, representando a metade N-terminal, de BYMVn foi sequenciada, os valores de homologia encontrados devem representar as diferenças reais existentes entre a CP deste isolado e as dos demais já caracterizados. Diferenças variando de 18,3 à 29,6% de nucleotídeos e de 12,0 à 25,5% de aminoácidos demonstram que mesmo dentro de uma espécie de potyvirus, variações significativas nas seqüências de nucleotídeos e de aminoácidos podem ser encontradas, refletindo as diferenças biológicas observadas entre este e os demais isolados. A análise dos valores de identidade e similaridade da seqüência de aminoácidos entre BYMVn e os demais isolados demonstrou que o isolado necrótico BYMVn é mais relacionado com a estirpe S. 62 Estudos adicionais de western blot mostraram uma massa molecular da CP de BYMVn de cerca de 30 kDa, sendo que a proteína manteve sua reatividade sorológica. O perfil peptídico da CP, obtido através de digestão tríptica e HPLC, mostrou que esta técnica pode ser usada na diferenciação de espécies de potyvirus, mas não permite localizar diferenças menores na seqüência de aminoácidos, como as responsáveis pela transmissão por afídeos.