Transferência de genoma em ovócitos bovinos frescos e vitrificados : produção de embriões

Abstract

A transferência de genoma (TG), o qual permite substituir um citoplasma danificado por um integro, pode ser uma alternativa para melhorar a eficiência da criopreservação de ovócitos bovinos. Neste trabalho objetivou-se estabelecer a técnica de TG utilizando a placa metafásica (PM) e corpúsculo polar (CP) de ovócitos bovinos como fontes do material genético. Para isso foram realizados quatro experimentos. No primeiro foi estabelecida a TG utilizando a PM (TG-PM) avaliando a concentração espermática a ser utilizada, a taxa de fecundação, a de polispermia e a de embriões. Na avaliação da concentração espermática, a taxa de fecundação foi maior (P<0,05) no grupo controle (76,1%) do que no TG-PM fecundados com 1x106 sptz/ml (46,9%) e com 0,5x106 sptz/ml (46%), que não diferiram entre si. Com relação à produção de embriões o grupo TG-PM apresentou taxas de clivagem (50%) e blastocisto (13,6%) inferiores ao grupo controle (80,2% e 32,6%,). No segundo experimento foram avaliados os mesmos parâmetros do primeiro, porém com estruturas submetidas à transferência de corpúsculo polar (TG-CP). Os resultados mostraram que o grupo TG-CP apresentou taxa de fecundação (82,3% x 96,2%) e de blastocisto (7,7% x 36,8%) inferiores, mas a taxa de clivagem (88,5% x 85,3%) semelhante ao grupo controle. No terceiro experimento foi avaliado o efeito da TG-PM e TG-CP na quantidade e distribuição de Grânulos Corticais (GC), Mitocôndrias (MT) e numero de cópias de DNA mitocondrial (mtDNA). A quantificação do GC foi semelhante (p> 0,05) entre as estruturas reconstruídas GT-PM (n = 22) e GT-CP (n = 20). No entanto, ambos os grupos apresentaram menos GC (p <0,05) que os grupos controle (n = 22) e enucleados (n = 20). Para distribuição do GC, o grupo GT-PM apresentou menos estruturas com distribuição periférica, diferente dos grupos controle e enucleado (p<0,05), mas não apresentou diferença significativa em relação ao grupo GT-CP (p> 0,05). Não foi observado diferença entre os grupos quanto a quantidade e distribuição de MT e quantidade de mtDNA. No quarto experimento foi realizada a TG-PM utilizando ovócitos vitrificados (TG-PMV) como fonte de material genético. Para isso, forma utilizados 3 grupos, TG-PMV, controle vitrificado (VIT) e controle PIVE. A taxa de clivagem do grupo TG-PMV (61,2%) foi semelhante ao grupo controle VIT (52,7%) e inferior (p<0,05) ao grupo controle PIVE (81,25%). Já a taxa de blastocisto não se diferiu do grupo controle VIT (8,9% e 3,6%) porem foram menores que o grupo controle PIVE (33,9%). Os resultados obtidos sugerem que as estruturas reconstruídas pela técnica de TG-PM e TG-CP são capazes de se desenvolver em embrião, e podem ser fecundados usando o mesmo protocolo utilizado na PIVE, sem aumento na taxa de polispermia. Além disso, os resultados mostraram que é possível produzir embriões por TG a partir de ovócitos vitrificados, possibilitando o uso de material genético armazenado em banco de germoplasma.