Expressão de celulases recombinantes de insetos praga em Pichia Pastoris™

Abstract

As celulases desempenham um papel significativo no processo industrial de degradação da celulose. Neste estudo, foi relatado a clonagem e a expressão heteróloga de uma β-glicosidase recombinante a partir do cDNA de T. licus licus (TlicB-gluc1) e uma β-1,4-endoglucanase recombinante do cDNA de A. grandis (AgraGH45-1). Os genes foram expressos em sistema heterólogo de Pichia pastorisTM.Baseado na predição de proteínas e busca por domínios conservados, foram clonadas as sequências gênicas TlicB-gluc1com identidade na família GH1 (Glicosil Hidrolase 1) e AgraGH45-1 com identidade na família GH45 (Glicosil Hidrolase 45). Os transcritos do gene clonado TlicB-gluc1apresentaram uma expressão gênica diferencial na fase larval adulta e no intestino médio em relação a carcaça e outras fases da vida do inseto. O perfil proteico do sobrenadante da colônia recombinante apresentou uma proteína diferencial de peso molecular estimado de aproximadamente 50 kDa. A enzima recombinante expressa mostrou-se ativa em pH 4,5 a 45 °C, de acordo com a faixa de pH e temperaturas das enzimas comerciais utilizadas nas indústrias. Também apresentou atividade β-glicosídica na degradação da carboximetilcelulose (CMC) e celobiose. No ensaio de açúcares redutores, observou-se a liberação de glicose no meio (4,76 mM) duas vezes superior em relação ao controle (2,13 mM). Os transcritos do gene clonado AgraGH45-1 apresentaram maior expressão gênica no intestino em ambos os estágios adulto e larval. O perfil protéico apresentou uma proteína de peso molecular estimado de aproximadamente 35 kDa. A enzima

recombinante expressa mostrou-se ativa em pH 5,0 a 50 °C na degradação de CMC e Hidroxietilcelulose (HEC). As enzimas recombinantes produzidas enste estudo mostraram-se eficientes na degradação de celuloses amorfas. Estes dados reforçam a importância de identificar a bioquímica digestiva desses insetos-praga, visando o potencial na produção de ferramentas biotecnológicas.