Produção de 2'-fucosil-lactose em Kluyveromyces lactis utilizando manose como fonte de carbono

Abstract

Os oligossacarídeos do leite humano (HMOs) possuem papel fundamental no desenvolvimento de recém-nascidos os protegendo contra toxinas e patógenos. O HMO encontrado em maior abundância é a 2'-fucosil-lactose (2'FL), sendo também o açúcar mais estudado e utilizado para suplementação de fórmulas neonatais. A sua via de síntese de novo utiliza como molécula precursora a manose, um epímero C2 da glicose. A forma polimérica desse açúcar, a manana, está presente em diversas biomassas vegetais como a semente de açaí, principal resíduo da produção de polpa de açaí. A hidrólise das sementes de açaí realizada pelo INT, recuperou mais de 90% dos açúcares presentes na semente em suas frações monoméricas fermentáveis, principalmente manose. Dessa forma, o principal objetivo deste estudo foi utilizar manose como fonte de carbono disponível a fim de estabelecer uma nova rota tecnológica para produção de 2'FL. A levedura que mostrou maior velocidade específica de crescimento em hidrolisado (0.0468 h-1) e a menor diferença cinética entre a utilização de glicose e manose foi a levedura Kluyveromyces lactis. Ademais, crescimentos em frascos mostraram pouca diferença cinética entre crescimento em manose (0.324 h-1) e glicose (0.348 h-1) nessa espécie. Esses resultados associados a características fisiológicas da espécie como o crescimento em lactose, uma das moléculas necessárias para síntese da 2'FL, tornam K. lactis um organismo promissor para o processo visado. Dessa forma, três cassetes de expressão gênica foram construídos para possibilitar a conversão da manose em 2'FL. Os genes gmd e fcl de Escherichia coli, cujas expressões possibilitam a síntese de GDP-fucose, foram inseridos em cassetes de expressão e clonados no plasmídeo pKLAC2. Adicionalmente, foi inserido ao vetor o gene da fucosiltransferase WcfB de Bacteroides fragilis otimizado para expressão em K. lactis que permite a conversão de GDP-Fucose em 2'FL. A cepa GG799 de K. lactis foi então transformada com os plasmídeos pFUC e p2WF e colônias selecionadas por crescimento em acetamida. Clones foram verificados em relação à presença dos genes no genoma da levedura. No entanto, análises preliminares de HPLC não detectaram 2’FL em meio contendo lactose.