Estabelecimento do processo de purificação da proteína rhPDGF-BB produzida em células HEK 293T

Abstract

As úlceras nas extremidades dos membros de pacientes diabéticos são complicações comuns que atingem cerca de 15% dos pacientes e que podem levar à graves consequências como a amputação de membros. O Becaplermin (Regranex®), produzido em Saccharomyces cerevisiae, é um fármaco comercializado e utilizado para o tratamento de tais feridas, através da atuação do homodímero da subunidade B do Fator de Crescimento Derivado de Plaquetas (PDGF-BB). A proteína recombinante humana (rh) PDGF-BB atua nos processos de cicatrização por sua ação quimiotática, ativando mecanismos celulares, como angiogênese e mitogênese; pode ser utilizada também na regeneração óssea e periodontal. Entretanto, efeitos adversos como erupção bolhosa, queimação no local de aplicação e hipertrofia da pele são relatados com o uso do Becaplermin. Tais relatos podem ser atribuídos ao sistema de expressão, que promove modificações pós-traducionais não expressadas em humanos, levando a uma resposta imune no organismo. A produção de proteínas recombinantes por células de mamífero (HEK 293T, por exemplo) gera moléculas que apresentam menor risco de efeitos colaterais quando comparadas a outros sistemas de expressão, pois possuem as modificações pós-traducionais que se assemelham às produzidas em humanos, bem como secretam a maioria das proteínas no meio de cultura, facilitando sua recuperação sem necessidade do rompimento celular. Esse trabalho teve como objetivo o estudo do estabelecimento do processo de purificação da proteína rhPDGF-BB produzida em células HEK 293T para duas colunas (HiTrap Heparin HP e HiTrap Phenyl FF), assim como a validação de testes colorimétricos para monitoramento de glicose, lactato, glutamina e ureia durante o cultivo celular e estudo do metabolismo. Os testes colorimétricos elaborados apresentaram valores subestimados para lactato e superestimados para glicose quando comparado aos resultados obtidos por HPLC, porém as curvas nos gráficos possuem perfil similar, indicando que podem ser utilizados como guias para entender a metabolização celular no meio de cultivo durante o processo de produção, possibilitando a tomada de decisões de forma rápida. A purificação do rhPDGF-BB na coluna HiTrap Heparin HP já é conhecida e gerou picos únicos e centralizados na eluição, mas a constatação da presença da proteína de interesse no pico purificado não foi possível devido à problemas com equipamentos. A coluna HiTrap Phenyl FF (High Sub) possui menor custo de compra e por isso se apresentou como uma boa alternativa à coluna de heparina, realizando testes de purificação da proteína para ela. O estabelecimento da purificação com esta coluna não foi estabelecido, pois o pico obtido estava deslocado para o final da eluição e não se encontrou molaridade adequada do sal utilizado para centralizar o pico de purificação. Entretanto, apresentou pico com altura similar à altura alcançada na coluna de heparina, apresentando-se como uma alternativa promissora para a continuação de estudos para outros sais e molaridades.