Avaliação da atividade imunomodulatória e/ou antifúngica dos peptídeos ToAP3 e ToAP4 obtidos de escorpião e dos peptídeos Polybia-MPII e Agelaia-MPI obtidos de vespa

Abstract

Peptídeos antimicrobianos (PAMs) são pequenas moléculas encontradas em todos os organismos pluricelulares, os quais podem ter atividades microbicidas e imunomodulatória. O objetivo do presente trabalho foi avaliar a atividade dos peptídeos ToAP3 e ToAP4 obtidos de escorpião e dos peptídeos Polybia-MPII e Agelaia-MPI obtidos de vespa, como potencial droga terapêutica nas infecções fúngicas. Para testar a atividade imunomodulatória dos PAMs ToAP3 e ToAP4, macrófagos derivados de medula óssea murina (BMDMs) ou células dendríticas derivadas de medula óssea (BMDCs) foram estimulados ou não com LPS na presença ou não dos PAMs ToAP3 ou ToAP4 para analisar sua capacidade de modular citocinas (TNF-α, IL-1β e IL-10) e produção de óxido nítrico. Os níveis de microRNA e RNAm foram determinados por qRT-PCR e as proteína dos genes que codificam as citocinas foram determinados por ELISA. Marcadores fenotípicos de ativação e diferenciação de BMDCs foram verificados por citometria de fluxo. Para análise antimicrobiana, avaliou-se a atividade dos PAMs contra o fungo Cryptococcus neoformans, verificando a concentração mínima inibitória (CMI), a possível associação entre os PAMs de vespas e escorpião por meio do ensaio de checkerboard, o mecanismo de ação dos PAMs Polybia-MPII e Agelaia-MPI pela permeabilidade da membrana ao iodeto de propídio e microscopia de força atômica, assim como a curva de sobrevivência em modelo de Galleria mellonella. Além disso, os PAMs Polybia-MPII e Agelaia-MPI foram encapsulados em nanopartículas de PMVE/MA e suas atividades avaliadas in vitro. Os resultados obtidos para os PAMs ToAP3 e ToAP4 mostraram que ambos possuem a capacidade de reduzir os níveis de transcritos de TNF-α e IL-1β, bem como a secreção das proteínas quando as células foram estimuladas com LPS. Analisando as BMDCs, os PAMs reduziram a secreção de TNF-α antes e depois do estímulo com LPS, e esta redução estava associada à ligação com o receptor do tipo Toll 4 (TLR-4). ToAP4 aumentou os níveis de moléculas de MHC-II estimulados com LPS, e o ToAP3 reduziu os níveis de moléculas co-estimulatórias. Na análise antimicrobiana, somente os PAMs Polybia-MPII e Agelaia-MPI foram capazes de atuar contra o fungo Cryptococcus neoformans e seu biofilme. Além disso, só os PAMs obtidos de vespa mostraram efeito aditivo na associação. O tratamento com estes PAMs causaram alterações na membrana e na morfologia fúngica. Estes resultados foram confirmados em ensaios in vivo utilizando a Galleria mellonella infectada com o C. neoformans. A análise da encapsulação mostrou que foi possível formular nanopartículas de PMVE/MA carregadas com o PAM Polybia-MPII ou Agelaia-MPI, sem alterar os efeitos dos PAMs frente ao fungo C. neoformans. No entanto, as concentrações de PAMs encapsuladas foram baixas. Tomados em conjunto, os resultados demonstraram que os PAMs, aqui analisados, apresentaram potencial para o desenvolvimento de novas terapias, capazes de modular a resposta imunológica do hospedeiro e/ou atuar contra infecções causadas pelo C. neoformans.