Identificação de microRNAs de macrófagos murinos expressos diferencialmente em resposta à infecção por Paracoccidioides brasiliensis

Abstract

MicroRNAs (miRNAs ou miRs) são pequenos RNAs não-codificadores endógenos, de cerca de 23 nucleotídeos, que desempenham importante papel regulatório, a nível pós-transcricional, atuando em inúmeros processos biológicos em animais e plantas. Dentre os inúmeros processos onde os miRNAs atuam, é de importância a modulação da resposta imune inata, área de interesse central nas pesquisas realizadas por nosso grupo. Na interface da interação hospedeiro-patógeno, uma intensa reprogramação da expressão gênica tanto do hospedeiro, como do patógeno é observada, sendo descrito que tais alterações são de grande relevância na resultante da interação. Dentre os genes amplamente descritos como modulados estão os miRNAs do hospedeiro na resposta à infecção por patógenos. Considerando o papel regulatório dos miRNAs, vários estudos mostram sua importância na resposta imune contra bactérias e vírus, mas pouco se sabe sobre seu papel em infecções fúngicas. Paracoccidioides brasiliensis é um fungo dimórfico que causa paracoccidioidomicose, considerada a micose sistêmica mais prevalente no Brasil, e que se faz presente na maioria dos países da América Latina. Dados preliminares de nosso grupo mostraram um maior acúmulo de miRNAs relacionados à resposta imune a P. brasiliensis, especialmente o miR-155. O objetivo deste trabalho é identificar miRNAs diferencialmente modulados na resposta de macrófagos murinos frente à infecção pelo isolado virulento Pb18 de P. brasiliensis. Foram infectados macrófagos primários derivados da medula-óssea (BMDMs) de camundongos de linhagem C57BL/6 com leveduras de P. brasiliensis, e o RNA total foi extraído após os tempos de 30’, 2h, 4h, 6h e 24h de infecção. A quantificação de miRNAs foi realizada por RT-qPCR utilizando o sistema TaqMan miRNA assay. Nesse estudo foram avaliados um conjunto de miRNAs já descritos como importantes na resposta imune a patógenos, tais como miR155 (5p e 3p), miR132, miR146a e miR125b. Os resultados revelam que, apesar de não ter havido modulação dos miRNAs nos tempos iniciais de interação fungo-macrófago, enquanto a partir de 6 e 24 horas de interação observamos um aumento no acúmulo do miR155 (as duas frações -5p e -3p) na célula hospedeira. Os transcritos miR146a e miR125b foram regulados negativamente tanto após 6 quanto após 24 horas de infecção, enquanto em nossos ensaios o miR132 não apresentou modulação em resposta à infecção por P. brasiliensis. Conforme descrito na literatura, o miR155-5p encontra-se relacionado com a indução de uma resposta inflamatória, enquanto os miR146a e miR125b, são descritos como reguladores negativos desta resposta. Em concordância com a resposta imune de BMDMs murinos à infecção por P. brasiliensis descrita na literatura, observamos um aumento de acúmulo de miRs relacionados a uma modulação positiva da resposta inflamatória e uma diminuição do acúmulo de miRs relacionados a uma regulação negativa de tal resposta. Assim, o aumento no acúmulo de miR pró-inflamatório (miR155-5p e -3p) juntamente com a diminuição no acúmulo de miRs anti-inflamatórios (miR146a e miR125b), descrito em BMDMs da linhagem murina C57BL/6 infectados por P. brasiliensis provavelmente resulta na ativação de uma resposta imune inflamatória, descrita como uma resposta protetora contra P. brasiliensis. Visando entender a via de sinalização envolvida na ativação do miR155, foram infectados BMDMs de camundongos deficientes para os receptores Dectina-1, Dectina-2, Toll-Like receptor (TLR) 2 e TLR 4 e foi feita a quantificação dos níveis do miR155-5p após 6 e 24 horas de infecção. Os resultados principais mostram a participação dos TLRs 2 e 4 e Dectina-2 na ativação do miR155-5p. Embora o mecanismo molecular envolvido na sinalização positiva, responsável pela indução da expressão do miR155-5p, não tenha sido abordada nos seus vários níveis, esse trabalho aporta novas informações sobre a base molecular tanto do reconhecimento de P. brasiliensis no modelo in vitro de BMDMs murinos, como também da modulação de importantes efetores regulatórios da resposta imune inata a este patógeno. Em conclusão, este trabalho traz novos dados sobre a modulação de miRNAs em resposta à P. brasiliensis, e sobre as primeiras etapas da via de ativação do miR155 frente à infecção por este patógeno.