Padronização e análise de transformação genética em Fonsecaea pedrosoi utilizando bombardeamento de partículas e Agrobacterium tumefaciens

Abstract

Fonsecaea pedrosoi, um fungo filamentoso pigmentado devido à produção de melanina, é o principal agente etiológico da Cromoblastomicose (CBM), uma doença com distribuição mundial, mas predominante em países tropicais e subtropicais. A biobalística é uma técnica amplamente utilizada para a direta entrega de material genético em células e tecidos intactos, pelo bombardeamento de partículas. Outro método bem estabelecido numa variedade de fungos é a transformação mediada por Agrobacterium, que consiste na transferência de um T-DNA da bactéria para a célulaalvo. Em F. pedrosoi não há relatos de protocolos estabelecidos para transformação genética, por isso a utilização de qualquer método requer otimização dos parâmetros. Neste estudo, foi utilizada a cepa CBS 271.37de F. pedrosoi para otimizar o bombardeamento de partículas, e transformação mediada por Agrobacterium. Além disto foram construídos vetores contendo marca de resistência à Higromicina B, Nourseotricina e Neomicina. O plasmídeo gGFP contendo o gene da proteína fluorescente GFP, também foi inserido por biobalística em F. pedrosoi para gerar transformantes verde fluorescentes que podem servir como linhagens repórter. Os transformantes obtidos a partir dos vetores contendo as marcas de resistência aos antibióticos foram avaliados quanto à estabilidade mitótica e a presença dos genes de resistência, confirmada por PCR. As condições testadas para biobalística, a distância das partículas às células alvo (6 e 9 cm) e o tempo de recuperação das células em meio não seletivo (24 e 48h), não apresentaram diferença significativa após análises estatísticas. Apesar disto, foi possível observar que um disparo de seis centímetros de distância e um tempo de incubação em meio não seletivo por 24 horas para recuperação das células foi o que proporcionou um maior número de transformantes (37 transformantesµg DNA para o plasmídeo construído neste trabalho, e 45 transformantesµg DNA para o plasmídeo pAN7.1). Nos experimentos com Agrobacterium a proporção de co-cultivo bactéria: fungo de 10:1 108 com tempo de incubação por 72 horas é o que proporciona maior número de transformantes (209 transformantes para plasmídeo pAD1625). Foram selecionados aleatoriamente transformantes resistentes a Higromicina B obtidos por ambas as técnicas para estimar o número de integrações de hph no genoma por Southern blot. Os dados mostraram que a utilização de biobalística para a transformação genética de F.pedrosoi é eficaz, bem como aquela mediada por Agrobacterium. Esta é a primeira vez que uma cepa de Fonsecaea foi geneticamente transformada e estes resultados abrem novas vias para melhor compreender a patobiologia do fungo usando estudos de função gênica.